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PDGF-BB诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞迁移机制的研究

郭艳  
【摘要】: 目的:动脉粥样硬化是威胁人类健康的主要原因,在我国动脉粥样硬化的发病率呈现逐年升高的趋势。血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖和迁移,是形成动脉粥样硬化的重要因素之一。多种细胞因子对血管平滑肌细胞的迁移有明显作用,如血管活性物质、生长因子和细胞外基质等。血小板源性生长因子(Platelet-Derived Growth Factor,PDGF)是一种重要的促细胞分裂原,它可以诱导血管平滑肌细胞从中膜迁移到内膜,是引起动脉粥样硬化的主要因素。血管平滑肌细胞的迁移涉及到促迁移信号的跨膜转导、细胞信号分子的级联活化及其细胞骨架蛋白的收缩和细胞变形等过程。其中PDGF是一种二硫化物的二聚体,由两个同质异形体A链和B链形成,有PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB三种形式。此因子在正常动脉中不表达,但在血管成型术后或者动脉粥样硬化引起的内皮细胞损伤时表达量都有所增加。因此,PDGF可能作为迁移的介质之一发挥着重要作用。其中,PDGF-BB来源于血小板、内皮细胞、巨噬细胞,作用于平滑肌细胞,具有趋化作用和刺激平滑肌细胞增殖的作用,是已知最强的血管平滑肌细胞体外趋化剂,可通过对细胞迁移信号通路的直接调控来控制血管平滑肌细胞的迁移,但是其相关的细胞内信号转导机制尚不十分清楚。本研究旨在研究PDGF-BB在血管平滑肌细胞迁移中作用的分子机制。 方法:(1)运用划痕实验方法,以不同浓度(1,5,10,20和50ng/ml)PDGF-BB为诱导剂,观察24h后的细胞迁移距离,确定PDGF-BB诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞迁移的最佳浓度:(2)使用ROCK特异抑制剂Y27632和MLCK抑制剂ML7,观察其对细胞迁移的影响;(3)运用免疫荧光方法,观察不同浓度PDGF-BB诱导后的F-actin和vinculin的形态学变化和加入抑制剂ML7和Y27632后F-actin和vinculin的形态学变化;(4)采用蛋白印迹技术,检测PDGF-BB诱导后的ROCKⅠ,ROCKⅡ蛋白表达量和MLC磷酸化水平的变化;(5)运用siRNA干扰技术,使ROCKⅠ和ROCKⅡ基因表达下调,或加入抑制剂Y27632和ML7后,检测ROCK下游分子MLC磷酸化水平的变化。 结果:(1)划痕实验法检测细胞迁移:PDGF-BB诱导细胞迁移的最佳浓度为10ng/ml;Y27632和ML7均抑制了细胞的迁移。(2)免疫荧光实验进行细胞的形态学观察:高浓度的PDGF-BB诱导细胞后,F-actin伪足明显增多,且纵向平行排列,形成应力纤维丝;而vinculin蛋白表达却明显减少,且在10ng/ml时比较明显;加入抑制剂ML7后,F-actin伪足减少,vinculin蛋白表达增多;加入抑制剂Y27632后,细胞形态发生较大改变,没有形成F-actin的应力纤维丝。(3)免疫印迹实验检测蛋白水平的变化:不同浓度的PDGF-BB诱导后,ROCKⅠ,ROCKⅡ蛋白表达量呈浓度依赖性增加。(4)甘油胶检测MLC磷酸化水平的变化:10ng/ml的PDGF-BB在不同时间诱导细胞后,MLC磷酸化水平没有明显的变化;ROCK基因表达下调和加入抑制剂后,MLC磷酸化水平均有降低。 结论:(1)PDGF-BB通过Rho激酶和MLCK两条信号通路诱导细胞迁移;(2)PDGF-BB诱导细胞迁移的过程中,能够引起细胞骨架的改变,即F-actin伪足增加,vinculin蛋白表达减少;(3)PDGF-BB诱导细胞迁移的过程中,未通过MLCK和ROCK下游的MLC磷酸化途径。


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