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三表法抗Ⅳ诱导小鼠肺炎TRAF2/NF-K BP65/MYD88蛋白活化时效研究

胡楠楠  
【摘要】:目的:建立甲型流感病毒FM1株滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型;正交设计麻杏石甘汤醇提方法,应用高效液相色谱法定量分析正交设计9水平麻杏石甘汤提取物中有效活性成分苦杏仁苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量;以“伤寒三表法”立论,观察三表法对甲型流感病毒FM1株感染鸡胚的防治作用及其对正常免疫、免疫低下小鼠流感病毒肺炎肺组织病毒载量的防治作用;探讨甲型流感病毒FM1株滴鼻感染正常免疫和免疫低下幼龄鼠诱导小鼠肺炎,小鼠肺组织中TRAF2、MYD88、NF-ΚBP65蛋白活化信号通路时效性关系。 材料与方法: 1建立不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠滴鼻感染甲型流感病毒FM1株诱导小鼠肺炎模型,以小鼠一般状态、存活只数、肺组织病变程度、肺指数和荧光探针PCR检测技术检测小鼠肺组织中不同时点IV-RNA的病毒载量差异,评价模型。 2采用正交实验设计方法,以乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间、提取次数为考察因素,以麻杏石甘汤9个供试品出膏率,和应用高效液相色谱分析法分析9个供试品中主要有效活性成分苦杏仁苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量,并将分析结果作为工艺评价指标,筛选最佳醇提方法。 3配制1%健康豚鼠血红细胞,应用血凝实验方法观察不同浓度银翘散提取物、玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物及三方不同组合的提取物,在不同时间点,体外直接抑制IV作用;研究不同浓度银翘散提取物、玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物及三方不同组合的提取物对IV感染鸡胚的预防和保护作用,筛选最佳配伍抗病毒药物为体内实验做前期研究。 4采用荧光探针检测方法,将不同免疫的幼龄小鼠分为正常免疫宣表组(麻杏石甘汤组)、正常免疫双表组(玉屏风散+银翘散组)、正常免疫三表组(玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组)、免疫低下三表组(玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组)、正常免疫利巴韦林组、免疫低下利巴韦林组、正常免疫模型组、免疫低下模型组,观察各组小鼠肺组织不同时点小鼠肺组织不同时点IV-RNA的病毒载量的差异,评价三表法对IV感染不同免疫状态的幼龄小鼠诱导小鼠肺炎的防治作用; 5采用荧光探针检测方法,将不同免疫的幼龄小鼠分为正常免疫宣表组(麻杏石甘汤组)、正常免疫双表组(玉屏风散+银翘散组)、正常免疫三表组(玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组)、免疫低下三表组(玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组)、正常免疫利巴韦林组、免疫低下利巴韦林组、正常免疫模型组、免疫低下模型组,观察各组小鼠肺组织不同时点小鼠肺组织不同时点IV-RNA的载量。 6采用免疫印迹技术(western blot),探讨三表法抗甲型流感病毒FM1株(IV)诱导不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠肺炎肺组织的TRAF2、MYD88、NF-ΚBP65蛋白活化信号通路的时效性关系。 结果: 1甲型流感病毒FM1株滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型比较研究: 1.1IV鸡胚半数感染量的测定(EID50):IV的EID50为10-6.5; 1.2甲型流感病毒FM1株感染不同鼠龄正常免疫昆明种小鼠诱导小鼠肺炎的比较研究:IV的EID550为10-4.;造模各组比较得出:幼龄、成龄及老龄正常组小鼠一般状态最好、全部存活;幼龄模型组一般状态最差,死亡最多,在第5天达到死亡高峰,与其他各组比较均有显著性差异(P<0.05);不同时点取小鼠肺组织,观察其外观病变程度,结果显示:各正常组小鼠在不同时点肺组织外观全肺野无病变;幼龄模型组肺组织病变最重,各时间点与正常组、成龄模型组、老龄模型组比较均有显著性差异(P<0.05)。肺指数比较:幼龄模型组肺指数最高,与正常组、成龄模型组及老龄模型组比较均有显著差异(P﹤0.05),感染第5天肺指数达到最高。成龄模型组肺指数与正常组比较无显著性差异(P﹥0.05),与幼龄模型组比较有显著差异(P﹤0.05),其肺指数明显低于幼龄模型组肺指数。老龄模型组肺指数与正常组比较在第3、5天无显著性差异(P﹥0.05),与正常组比较在第7天有显著差异(P﹤0.05),与幼龄模型组比较有显著差异(P﹤0.05),其肺指数明显低于幼龄模型组肺指数。荧光定量PCR检测结果得出:幼龄鼠肺组织病毒载量最高,与其他各组比较有显著性差异(P﹥0.05)。 1.3甲型流感病毒FM1株感染不同鼠龄免疫低下动物模型的比较研究:IV的EID50为10-5.5;结果表明:幼龄、成龄正常组小鼠一般状态最好、全部存活,幼龄CP组状态较成龄CP组状态差,幼CP+IV组一般状态最差,死亡最多,在造模后7天内大批死亡,14天内共死亡13只,与正常组及成龄模型组比较均有显著性差异(P<0.05)。成CP+IV组14天内共死亡5只,与正常组比较有显著性差异(P>0.05)。不同时点取小鼠肺组织,观察其外观病变程度,结果显示:幼NS组、成NS组、幼CP组、成CP组,各组小鼠在不同时点肺组织外观全肺野无病变;幼CP+IV组肺组织病变最重,各时间点与其他各组比较均有显著性差异(P<0.05),幼龄CP+IV组第5天与第3天比较,病变明显加重,有显著性差异(P<0.05),第7天与第5天比较病变明显加重,有显著性差异(P<0.05),说明第5-7天为幼龄CP+IV组肺组织病变最明显时期;成龄CP+IV组第3天出现较为明显的肺组织病变,第5天肺组织病变减轻,第7天与第5天比较无显著性差异(P>0.05)。各组小鼠在不同时点肺指数比较:幼CP+IV组肺指数最高,与其他各组比较均有显著差异(P﹤0.05),感染第5天肺指数达到最高。成CP+IV组肺指数在第7天达到最高,与正常组比较有显著性差异(P﹤0.05),与:幼CP+IV组比较有显著差异(P﹤0.05),其肺指数明显低于:幼CP+IV组肺指数。荧光定量PCR检测结果得出:幼龄鼠肺组织病毒载量最高,与其他各组比较有显著性差异(P﹥0.05)。 2正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取方法研究与银翘散、玉屏风散醇提取物的制备 2.1正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取方法研究 采用正交实验设计方法,以乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间、提取次数为考察因素,以麻杏石甘汤中主要有效活性成分苦杏仁苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的定量检测及出膏率作为工艺评价指标,筛选最佳醇提方法。出膏率分别为:1号供试品,9.864%;2号供试品,16.891%;3号供试品,14.353%;4号供试品,13.878%;5号供试品,17.600%;6号供试品,13.947%;7号供试品,11.150%;8号供试品,16.389%;9号供试品,14.298%。由直观分析及方差分析结果可见:对出膏率影响最大的为提取次数,其次为提取时间和乙醇浓度,溶媒倍数影响较小。 2.2银翘散精简方、玉屏风散醇提提取物的制备 银翘散精简方:出膏率为16.46g,出膏率为14.44%;玉屏风散醇提出膏率为53.7810g,出膏率为25.16% 3高效液相色谱法定量分析有效活性成分 正交设计9水平供试品有效活性成分苦杏仁苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量苦杏仁苷含量从高到低依次为:6号(2333)8倍90%乙醇150min热回流3次;3号(1333)6倍90%乙醇150min热回流3次;8号(3222)10倍70%乙醇120min2次;7号(3111)10倍50%乙醇90min热回流1次;5号(2222)8倍70%乙醇120min热回流2次;2号(1222)6倍70%乙醇120min热回流2次;9号(3333)10倍90%乙醇150min热回流2次;4号(2111)8倍50%乙醇90min热回流1次;1号(1111)6倍50%乙醇90min热回流1次。 盐酸麻黄碱含量从高到低依次为:5号(2222)8倍70%乙醇120min热回流2次;2号(1222)6倍70%乙醇120min热回流2次;9号(3333)10倍90%乙醇150min热回流2次;3号(1333)6倍90%乙醇150min热回流3次;4号(2111)8倍乙醇90min热回流1次;7号(3111)10倍50%乙醇90min热回流1次;1号(1111)6倍50%乙醇90min热回流1次;最少为6号(2333)8倍90%乙醇150min热回流3次和8号(3222)10倍70%乙醇120min2次。 盐酸伪麻黄碱含量从高到低依次为:5号(2222)8倍70%乙醇120min热回流2次;8号(3222)10倍70%乙醇120min2次;2号(1222)6倍70%乙醇120min热回流2次;9号(3333)10倍90%乙醇150min热回流2次;3号(1333)6倍90%乙醇150min热回流3次;4号(2111)8倍乙醇90min热回流1次;7号(3111)10倍50%乙醇90min热回流1次;1号(1111)6倍50%乙醇90min热回流1次;最少为6号(2333)8倍90%乙醇150min热回流3次。 4三表法药效学体内外实验研究 4.1三表法对流感病毒感染鸡胚的保护作用实验研究 4.1.1IV鸡胚半数感染量的测定(EID50):EID.550为10--6; 4.1.2中药提取物最大不凝血浓度:银翘散提取物最大不血凝的浓度均为2-4,即1.2234mg提取物量/ml;玉屏风散提取物最大不血凝的浓度均为2-6,即0.5656mg提取物量/ml;麻杏石甘汤提取物最大不凝血的浓度为2-6,即0.3109mg提取物量/ml;银翘散提取物、玉屏风散提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-5,即银翘散2.4469mg提取物量/ml+玉屏风散1.1312mg提取物量/ml等比混合;银翘散提取物、麻杏石甘汤提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-5,即银翘散2.4469mg提取物量/ml+麻杏石甘汤0.6218mg提取物量/ml等比混合;玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-6,即玉屏风散0.5656mg提取物量/ml+麻杏石甘汤0.3109mg提取物量/ml等比混合;银翘散提取物、玉屏风提取物、麻杏石甘汤提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-5,银翘散2.4469mg提取物量/ml+玉屏风散1.1312mg提取物量/ml+麻杏石甘汤0.6218mg提取物量/ml等比混合; 4.2.3各组药供试液在不同时间1-36h内体外直接抑制病毒作用:银翘散提取物、玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物及不同组合的提取物混合药物均可不同程度直接抑制甲型流感病毒FM1的活性,作用时间从1h可持续到36h,按3.3的结果各组最大不凝血浓度供试液在不同时间点均能不同程度抑制病毒的增殖;其中药物在6小时~20小时范围内抑制病毒效果显著,12小时后作用逐渐减弱;银翘散提物体外直接抑制病毒作用在6小时最强,其抑制病毒滴度可达12倍;玉屏风散提取物体外直接抑制IV作用在12小时最强,抑制作用可持续达到8倍;麻杏石甘汤提取物体外直接抑制IV作用在6小时最强,抑制作用可持续达到12倍;银翘散提取物与玉屏风散提取物混合药物体外直接抑制IV作用在6小时最强,其抑制病毒滴度可达12倍;银翘散提取物与麻杏石甘汤提取物混合药物体外直接抑制IV作用在6-12小时最强,抑制作用可持续达到12倍;玉屏风散提取物与麻杏石甘汤提取物混合药物体外直接抑制IV作用在12小时最强,抑制作用可持续达到8倍;三方提取物混合药物但总体来说,体外直接抑制IV作用在6小时最强,抑制作用可持续达到8倍;各组提取物在不同时间点与西药利巴韦林对照组相比较未见优势。 4.2.4各组提取物供试液对鸡胚最大无毒浓度的测定(TD0):各组受试液最大无毒浓度为:A组银翘散19.5mg提取物/ml;B组玉屏风散36.2m提取物/ml;C组麻杏石甘汤9.95mg提取物/ml;混合提取组,由于是混合药物的等比配制,所以其浓度按各自2倍比稀释浓度相加平均值计算,如下:D组银翘散+玉屏风散57.5mg混合提取物/ml;E组银翘散+麻杏石甘汤48.95mg混合提取物/ml;F组玉屏风散+麻杏石甘汤14.025mg混合提取物/ml;G组银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤22.4mg混合提取物/ml。 4.2.5三表法对甲型IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用研究银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤提取物各浓度对IV感染鸡胚的预防作用与利巴韦林比较无明显优势;银翘散+玉屏风散提取物、银翘散+麻杏石甘汤提取物、玉屏风散+麻杏石甘汤提取物各浓度对IV感染鸡胚的预防作用与利巴韦林比较无明显优势;银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤提取物22.42mg/ml时,对IV感染鸡胚的预防作用与利巴韦林比较有明显优势。银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤提取物对IV感染鸡胚的治疗作用:银翘散提取物各浓度对IV感染鸡胚的治疗作用与利巴韦林比较无明显;玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物、银翘散+麻杏石甘汤提取物各组对IV感染鸡胚的治疗作用与利巴韦林比较无明显优势,可能其抗病毒作用弱于利巴韦林对照组;银翘散+玉屏风散提取物57.5mg/ml浓度时、屏风散+麻杏石甘汤提取物高浓度时、银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤提取物在22.42mg/ml、11.2mg/ml、5.63mg/ml浓度时,对IV感染鸡胚的治疗作用与利巴韦林比较有明显优势。 5三表法对甲型流感病毒滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的IV-RNA荧光定量肺组织IV载量的作用:三表法对与正常免疫IV诱导小鼠肺炎治疗效果更好,正常免疫三表组在第5、7天与其余各组比较用药后流感病毒载量,有显著差异(P<0.05) 6三表法对甲型流感病毒FM1株感染小鼠TRAF2、MYD88、NF-ΚBP65蛋白活化信号通路时效性关系的研究:7天内各组小鼠肺组织TRAF2蛋白表达呈稳定状态;正常免疫三表组在各时间点,其肺组织NF-ΚBP65蛋白表达最弱,并呈稳定趋势;正常免疫宣表组、免疫低下三表组、正常免疫模型组,肺组织NF-ΚBP65蛋白表达较为稳定,纵比组间,横比不同时间点,均无显著差异(P﹥0.05)。三表方药适时作用于正常免疫小鼠,可使其肺组织NF-ΚBP65蛋白表达减弱;正常免疫三表组是各组间、各时间点中,其肺组织MYD88蛋白表达最弱的,并且各组随着时间的进展,肺组织MYD88蛋白表达趋于平稳。整体看来三表方药适时作用于正常免疫小鼠,可使其肺组织NF-ΚBP65蛋白表达减弱;无药物干预的免疫低下模型组其肺组织MYD88蛋白表达在第5天大幅下降,推测可能与其免疫低下相关。 3结论: 3.1通过小鼠一般状态观察、肺组织病理观察、肺组织IV-RNA的荧光定量测定综合判定验证,幼龄鼠可以成功塑造小鼠IV感染小鼠肺炎模型,虽然成龄鼠、老龄鼠模型组肺组织荧光定量PCR检测有IV病毒活动的迹象,但其肺组织病理HE未观察到肺炎病理改变,故成龄鼠、老龄鼠不能成功造模,幼龄鼠对流感病毒更具易感性,易造成IV肺炎模型。一次性大剂量的给予环磷酰胺腹腔注射,可以造成小鼠脾脏指数的升高,胸腺指数的下降,可以造成小鼠的免疫低下状态;通过小鼠一般状态观察、肺组织病理观察、肺组织IV-RNA的荧光定量测定验证,幼龄鼠可以成功塑造IV感染免疫低下小鼠肺炎模型,成龄鼠不能成功造模;免疫低下幼龄鼠对流感病毒更具易感性,易造成IV感染免疫低下小鼠肺炎模型。 3.2采用不同浓度的乙醇为提取溶媒对麻杏石甘汤进行提取,对麻杏石甘汤复方中绝大多数药材中的活性成分均有较好的提取效果,提取溶媒量及提取次数是影响出膏量重要因素,其次为提取时间。由直观分析及方差分析结果可见,对出膏率影响最大的为提取次数,其次为提取时间和乙醇浓度,溶媒倍数影响较小。 3.3溶媒的浓度是决定正交设计9水平麻杏石甘汤有效活性成分醇提取含量多少的的重要因素,其次为提取时间和提取次数 3.4不同浓度银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤提取物对IV感染鸡胚具有较好的预防和治疗保护作用,其预防和治疗作用随药物浓度降低而有所减弱,但其对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用与西药利巴韦林相当,未见明显优势。不同浓度银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤混合物联合用药比单方对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用略强,与西药利巴韦林相当,其银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤提取物对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用优于利巴韦林注射剂,体现明显优势,给药先后顺序对血凝效价结果无显著影响。 3.5从不同时间点的各组小鼠肺组织流感病毒载量来看,模型组其肺组织病毒载量随时间呈递增趋势;用药各组其肺组织病毒载量随时间成递减趋势;适时用药,变换方药比单方治疗更能抑制肺组织流感病毒病毒载量。 3.6在IV诱导幼龄鼠肺炎的发病过程中,TRAF2/NFΚBP65/MYD88信号通路激活。三表方药适时作用于正常免疫小鼠,可使其肺组织TRAF2/NFΚBP65/MYD88蛋白活化表达稳定。7天内各组小鼠肺组织TRAF2蛋白表达呈稳定趋向状态。无药物干预的免疫低下模型组其肺组织MYD88蛋白表达在第5天大幅下降,推测可能与其免疫低下相关。


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4 张忠霞;美完成2000多种流感病毒基因组测序工作[N];医药经济报;2007年
5 刘英;我市采取措施积极防范[N];张家界日报;2009年
6 特约记者吴志军 通讯员郝成涛;病毒检测试剂形成配套体系[N];健康报;2009年
7 张忠霞;2000多种流感病毒基因组测序工作完成[N];人民日报;2007年
8 记者 陈芳 通讯员 贺黎;市疾控中心分离出3株A1型流感病毒[N];三峡日报;2006年
9 本报记者 刘霞;抱着“枪”睡大觉[N];科技日报;2009年
10 记者 冯海波 通讯员 刘慧婵 钟萱;三分钟便可筛查病毒[N];广东科技报;2009年
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