泻火化瘀通窍法改善豚鼠耳蜗微循环障碍的实验研究

【摘要】：目的：突发性耳聋是耳鼻咽喉科常见病、多发病，属中医“暴聋”范畴，目前发病率呈明显上升趋势。祖国医学在长期的耳聋诊治临床实践中摸索和积累了丰富的经验，许多复方制剂具有对耳蜗微循环障碍多靶点调控的作用，情志致病和心理因素已成为耳鸣耳聋的发病中和转归的重要因素之一。现代医学研究表明活血化瘀、改善微循环治疗有一定的疗效，因此将祖国医学清肝泻火法与活血化瘀法有机的结合起来形成泻火化瘀通窍法可能获得更好的疗效，大量的临床研究已经证实了这一点，其代表方剂为泻火治聋冲剂，经过大量的临床观察，有很好的疗效。本实验旨在（1）泻火化瘀通窍法对豚鼠耳蜗微循环障碍的影响。（2）泻火化瘀通窍法对光化学诱导法所致豚鼠耳蜗微循环障碍耳蜗组织VEGF及bFGFmRNA表达的影响。（3）泻火化瘀通窍法对光化学诱导法所致豚鼠耳蜗微循环障碍耳蜗组织iNOSmRNA、 MMP-2mRNA表达的影响。（4）泻火化瘀通窍法对光化学诱导法所致豚鼠耳蜗微循环障碍耳蜗组织Bcl-2mRNA、BaxmRNA及其蛋白表达的影响。通过以上实验来研究根据中医“火”、“瘀”致病理论创立的泻火化瘀通窍法对耳蜗微循环障碍的改善调控及分子生物学作用机制。 材料与方法： 动物造模与分组：采用光化学诱导法造模，造模成功后，将豚鼠分成5组，即正常组、模型组、行气组、活血化瘀组、泻火化瘀通窍组，每组10只。 实验方法：正常组：予0.9%生理盐水4ml/只/天，每日分二次给药，共连续灌胃10天；模型组：术后12h，予0.9%生理盐水4ml/只/天灌胃，每日分二次给药，共连续灌胃10天；行气组：术后12h予行气中药4ml/只/天灌胃（含生药1g），每日分二次给药，共连续给药10天；活血化瘀组：术后12h，予活血化瘀药物4ml/只/天灌胃（含生药2g），每日分二次给药，共连续给药10天。泻火化瘀通窍组：术后12h，予泻火化瘀通窍药物4ml/只/天灌胃（含生药4g），每日分二次给药，共连续给药10天。 实验指标：（1）各组豚鼠分别于造模后、用药前及停药后1天检测ABR阈值；（2）利用体式解剖显微镜进行螺旋韧带和耳蜗基底膜铺片，对血管纹和毛细胞进行观察；（3）利用TBA法和可见光法对耳蜗组织MDA及CAT进行检测；（4）采用实时荧光定量PCR方法检测耳蜗组织VEGF及bFGFmRNA表达；（5））采用实时荧光定量PCR方法检测耳蜗组织iNOSmRNA、 MMP-2mRNA表达；（6）采用实时荧光定量PCR方法检测耳蜗组织Bcl-2及Bax mRNA表达；（7）采用Western blot蛋白免疫印迹法检测VEGF、Bcl-2及Bax蛋白的表达。统计学处理：采用SPSS11.5软件包进行统计分析，计量资料实验数据以平均值±标准差（x|-±S）表示，单因素方差分析（One-Way ANOVA）,组间比较采用最小显著差法（LSD）方法，以P﹤0.05，P﹤0.01作为显著性和极显著性差异的标准。 结果： 1、泻火化瘀通窍组治疗后ABR阈值明显低于活血化瘀组及行气组P﹤0.05，且活血化瘀组治疗后ABR阈值明显低于行气组P﹤0.05；各组与正常组及模型组相比较均有显著性差异P＜0.01。 2、正常组螺旋韧带血管纹显示基本正常；模型组可见耳蜗螺旋韧带血管纹血管内大量微血栓形成，血管粗细明显不均，部分血管中断；行气组可见耳蜗螺旋韧带血管纹血管内大量微血栓形成，血管粗细明显不均，部分血管中断；活血化瘀组可见耳蜗螺旋韧带血管纹血管内微血栓，未见血管明显中断，较泻火化瘀通窍组微血栓多一些；泻火化瘀通窍组可见耳蜗螺旋韧带血管纹血管内少量微血栓，未见血管中断。 3、耳蜗基底膜铺片显微结构显示：正常组外毛细胞分布呈三排，显示清晰，排列整齐，分布均匀，无明显缺失；模型组见外毛细胞大部分变形，排列严重紊乱，崩解破坏，大片缺损，细胞连接消失，纤毛倒伏严重；行气组见外毛细胞部分变形，出现较多片状缺损，部分细胞连接消失；活血化瘀组见外毛细胞排列较为整齐，部分变形，部分出现坏死；泻火化瘀通窍组见外毛细胞排列整齐，散在缺失，个别轮廓不清。模型组及行气组外毛细胞损伤较重，泻火化瘀通窍组及活血化瘀组外毛细胞损伤相对较轻，且活血化瘀组损伤较泻火化瘀通窍组明显。 4、泻火化瘀通窍组MDA含量明显低于活血化瘀组及行气组P﹤0.05，而CAT含量明显高于活血化瘀组及行气组P﹤0.05；与正常组及模型组相比较均有极显著性差异P＜0.01。 5、各治疗组VEGFmRNA的表达均明显高于模型组p﹤0.01，且泻火化瘀通窍组高于活血化瘀组及行气组P﹤0.05，活血化瘀组高于行气组P﹤0.05。泻火化瘀组VEGFmRNA的表达量约是活血化瘀组的2.4倍，约是行气组的6.8倍，约是模型组的8.8倍；VEGF蛋白表达为行气组与模型组VEGF/β-actin相比较无显著性差异P＞0.05；活血化瘀组与行气组VEGF/β-actin相比较有显著性差异P﹤0.05；泻火化瘀组与活血化瘀通窍组VEGF/β-actin相比较有显著性差异P﹤0.05。 各治疗组bFGF mRNA的表达均明显高于模型组p﹤0.05，且泻火化瘀通窍组高于活血化瘀组及行气组p﹤0.05，活血化瘀组高于行气组p﹤0.05。泻火化瘀组bFGF mRNA的表达量约是活血化瘀组的1.4倍，约是行气组的4.2倍，约是模型组的6.3倍。 6、正常组与各治疗组iNOSmRNA的表达均明显低于模型组p﹤0.05，且泻火化瘀通窍组iNOSmRNA的表达量与活血化瘀组接近p﹥0.05，模型组iNOSmRNA的表达约是行气组的1.3倍，约是活血化瘀组的4.7倍，约是泻火化瘀通窍组的4.6倍；各治疗组MMP-2mRNA的表达均明显低于模型组P﹤0.05，模型组MMP-2mRNA的表达是是行气组的1.5倍；是活血化瘀组的2.4倍；是泻火化瘀通窍组的7.3倍。 7、各组Bax mRNA的表达均明显低于模型组P﹤0.05，且泻火化瘀通窍组低于活血化瘀组及行气组P﹤0.05，活血化瘀组低于行气组P﹤0.05。模型组Bax mRNA的表达量约是行气组的2.2倍；约是活血化瘀组的4.4倍；约是泻火化瘀通窍组的6.4倍；约是正常组的14.8倍。行气通组Bax mRNA的表达量约是活血化瘀组的2倍；约是泻火化瘀通窍组的3倍。活血化瘀组Bax mRNA的表达量约是泻火化瘀通窍组的1.5倍；各治疗组Bcl-2mRNA的表达均明显高于模型组P﹤0.05，且泻火化瘀通窍组高于活血化瘀组及行气通窍组P﹤0.05，活血化瘀组高于行气组P﹤0.05。泻火化瘀通窍组Bcl-2mRNA的表达量约是活血化瘀组的2.5倍，约是行气通窍组的6倍，约是模型组的17倍。 8、蛋白表达：Bcl-2/Bax比值泻火化瘀通窍组﹥活血化瘀组﹥行气组﹥模型组，且各组比较均有显著性差异,p﹤0.05。 结论： 1、泻火化瘀通窍法具有加强改善微循环及加强抗脂质过氧化的作用。 2、泻火化瘀通窍法可有效改善光化学法所致豚鼠耳蜗微循环障碍，且优于活血化瘀法 3、单纯行气法对光化学法所致豚鼠耳蜗微循环障碍无明显效果。 4、泻火化瘀通窍法能够明显提高豚鼠耳蜗微循环障碍耳蜗组织VEGF和bFGF的表达,优于活血化瘀法和行气法。 5、泻火化瘀通窍法可能通过促进VEGF和bFGF的表达，来促进新生血管的形成，改善微循环障碍。 6、泻火化瘀通窍法与活血化瘀法均能够抑制iNOS的表达，保护耳蜗组织的缺血损伤，明显优于行气法。 7、泻火化瘀通窍法、活血化瘀法与行气法均能够抑制MMP-2的表达。 8、Bcl-2和Bax基因和蛋白均参与豚鼠耳蜗微循环障碍损伤，而且损伤后Bcl-2/Bax比值下降是促进凋亡的重要因素。 9、泻火化瘀通窍法和活血化瘀法均能通过显著提高Bcl-2/Bax比值，抑制细胞凋亡。 10、泻火化瘀通窍法抑制细胞凋亡能力高于活血化瘀法。 11、 iNOS与Bc1-2的表达关系密切，iNOS的表达与Bcl-2/Bax比值呈负相关。