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针刺对皮肤光老化大鼠p38MAPK和NF-κB信号传导通路影响的实验研究

张小卿  
【摘要】:目的:本项研究通过体内实验,旨在探讨模拟日光中UV照射所致皮肤光老化大鼠细胞凋亡和凋亡相关调控基因的表达情况,以及p38MAPK和核转录因子kappaB(NF-κB)信号传导通路在光老化发生机制中的作用;并研究针刺疗法在皮肤光老化的干预过程中的作用机制,以期发掘出对光老化有明确防治作用的针刺疗法。 材料与方法:本研究采用UVA+UVB光源(40W紫外线灯管:UVB灯管5根,UVA灯管2根)照射大鼠背部皮肤制备大鼠皮肤光老化模型。每只大鼠均用电推剪剪除大鼠背部5.0cm×5.0cm区域内毛发,放置于自制紫外线灯箱中。适应环境饲养一周后,第2周开始每天照射2h,第3-7周每天照射4h,第8-13周每天照射6h,照射以5天为一个周期,间隔2天,再开始下一个周期,直至造模成功。采用针刺为实验因素,维生素E为阳性对照药,以皮肤组织中氧自由基含量、抗氧化酶类活力、细胞凋亡情况、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达及p38MAPK、NF-κB信号传导通路中相关基因和蛋白表达为效应指标进行体内实验。实验大鼠随机分为正常组、模型空白组、针刺组、维生素E组(简称VE组),各组于造模前分别进行针刺和外涂相应药物后进行紫外线照射;13周后处死动物,取背部皮肤组织检测以下指标:比色法检测丙二醛(MDA)、过氧化氢(H_2O_2)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力;免疫组化法检测Bcl-2和Bax蛋白表达及凋亡阳性细胞数目;RT-PCR法检测c-Jun、c-Fos、p38MAPK、NF-κB、MMP-1mRNA表达;Western Blot法检测蛋白c-Jun、c-Fos、p38MAPK、NF-κB、MMP-1蛋白表达。 结果: 1.大鼠体征表现:正常组大鼠实验全程皮肤无明显改变,皮毛有光泽,活泼喜动,食欲佳,食量正常。模型空白组大鼠13周实验结束时皮毛光泽度下降,皮肤增厚,弹性丧失,出现宽而深的皱纹。针刺组和VE组上述表现均有不同程度的改善,其中针刺组效果更好。 2.各组大鼠体重变化:实验第1周各组大鼠体重比较,无明显差异(P>0.05)。在实验进行至第13周末时,各组大鼠体重比较具有明显差异。与正常组比较,各组大鼠体重均明显下降,其中以模型空白组下降最为明显(P<0.01);与模型空白组比较,各治疗组体重均明显升高,具有显著差异(P<0.01)。 3.大鼠皮肤组织SOD活性:与正常组比较,模型空白组大鼠SOD活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型空白组比较,针刺组和VE组SOD活性均升高,差异有统计学意义(P<0.01)。 4.大鼠皮肤组织MDA含量:与正常组比较,模型空白组大鼠MDA含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),而针刺组无显著性差异(P>0.05);与模型空白组比较,针刺组和VE组MDA含量均降低,差异有统计学意义(P<0.01)。 5.大鼠皮肤组织H_2O_2含量:与正常组比较,模型空白组大鼠H_2O_2含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型空白组比较,针刺组H_2O_2含量降低,差异有统计学意义(P<0.01),而VE组无显著性差异(P>0.05)。 6.大鼠皮肤组织CAT活性:与正常组比较,模型空白组大鼠CAT活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),而针刺组无显著性差异(P>0.05);与模型空白组比较,针刺组CAT活性升高,差异有统计学意义(P<0.01),而VE组无显著性差异(P>0.05)。 7.大鼠皮肤组织GSH-Px活性:与正常组比较,模型空白组大鼠GSH-Px活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型空白组比较,针刺组和VE组GSH-Px活性均升高,差异有显著意义(P<0.01)。 8.大鼠皮肤组织免疫组化染色结果: (1)大鼠皮肤组织Bcl-2和Bax蛋白平均灰度值:与正常组比较,模型空白组大鼠Bcl-2蛋白表达的平均灰度值增加,表明蛋白含量减少,差异有统计学意义(P<0.01);与模型空白组比较,针刺组和VE组蛋白表达的平均灰度值减弱,表明蛋白含量增加,差异有统计学意义(P<0.01);Bax蛋白表达呈相反趋势。 (2)大鼠皮肤组织凋亡阳性细胞数:正常组皮肤组织凋亡细胞存在散在阳性表达,模型空白组呈弥散阳性表达,凋亡阳性细胞数与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01);针刺组和VE组均呈散在阳性表达,凋亡阳性细胞数与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。 9.RT-PCR结果:正常大鼠皮肤组织可检测到c-Jun、c-Fos mRNA、p38MAPK、NF-κB、MMP-1表达。 (1)c-Jun mRNA表达:与正常组比较,模型空白组表达明显升高(P<0.01);与模型空白组比较,针刺组和VE组表达显著下调(P<0.01);针刺组和VE组比较差异无统计学意义(P>0.05)。 (2)c-Fos mRNA表达:与正常组比较,模型空白组表达明显升高(P<0.01);与模型空白组比较,针刺组和VE组表达显著下调(P<0.01);针刺组和VE组比较差异无统计学意义(P>0.05)。 (3)p38MAPK、NF-κB、MMP-1mRNA表达:与正常组比较,模型空白组表达明显升高,(P<0.01);与模型空白组比较,针刺组和VE组表达均显著下调,差异有统计学意义(P<0.01)。 10.Western blot结果:正常大鼠皮肤组织可检测到c-Jun、c-Fos、p38MAPK、NF-κB和MMP-1蛋白表达。 (1)c-Jun蛋白表达:与正常组比较,模型空白组表达明显升高(P<0.01);与模型空白组比较,针刺组和VE组表达显著下调,差异有统计学意义(P<0.01)。 (2)c-Fos蛋白表达:与正常组比较,模型空白组表达明显升高(P<0.01);与模型空白组比较,针刺组和VE组表达显著下调(P<0.01)差异有统计学意义(P<0.01)。 (3)p38MAPK、NF-κB、MMP-1蛋白表达:与正常组比较,模型空白组表达明显升高(P<0.01);与模型空白组比较,针刺组和VE组表达显著下调(P<0.01);针刺组和VE组比较,针刺组NF-κB和MMP-1蛋白下调更为显著,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1.针刺可用于防治大鼠皮肤光老化,能降低光老化大鼠皮肤组织氧自由基含量,提高抗氧化酶类活性。 2.针刺可下调大鼠光老化皮肤组织促凋亡基因Bax蛋白表达、上调凋亡抑制基因Bcl-2蛋白的表达,从而减少皮肤细胞凋亡数目,这是实现针刺抗皮肤光老化的主要机制之一。 3.UV照射活化了皮肤组织p38MAPK,激活了MAPK信号传导通路,进而导致MMP-1升高;同时,UV辐射形成的ROS,激活了下游NF-κB信号传导通路,也能上调靶基因MMP-1的表达,使细胞外基质成分降解,形成皮肤光老化。 4.针刺对抗皮肤光老化途径之一是抑制皮肤组织p38MAPK和NF-κB表达,进而降低MMP-1生成,阻止其降解细胞外基质成分,起到抗皮肤光老化的作用。


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