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基于对相关细胞因子及NF-KB的调控探讨妇炎宁汤治疗慢性盆腔炎的免疫学机制

孙晶  
【摘要】:第一部分导师治疗慢性盆腔炎学术思想研究目的:探讨妇炎宁汤治疗慢性盆腔炎的中医理论依据。方法:总结整理导师妇炎宁汤治疗慢性盆腔炎的中医理论。从《黄帝内经》的发病观角度出发,阐述慢性盆腔炎的病机特点;以扶正和祛邪为切入点,分析妇炎宁汤治疗慢性盆腔炎的可行性;结合古代文献以及现代药理研究成果,证明导师妇炎宁汤的组方依据。结论:中医理论及现代药理研究能够支持妇炎宁汤治疗慢性盆腔炎的可行性及有效性第二部分动物实验实验一妇炎宁汤对慢性盆腔炎模型大鼠相关细胞因子及NF-KB的影响目的:通过观察慢性盆腔炎模型大鼠血清、子宫组织中炎症细胞因子、粘连相关指标及核因子的变化,探讨妇炎宁汤治疗慢性盆腔炎的免疫调节机制。材料与方法:以SD雌性大鼠为实验对象,采用混合细菌注射宫腔的方法,复制慢性盆腔炎动物模型。将大鼠随机分为正常对照组、慢性盆腔炎模型组、妇炎宁汤低、中、高剂量组及康妇炎胶囊组,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组大鼠血清的炎症细胞因子水平,包括白介素-8(IL-8)、白介素-4(IL-4)。大鼠子宫形态学观察后,ELISA法检测各组大鼠子宫组织中粘连相关细胞因子细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、转化生长因子-β(TGF-β)的表达,荧光实时定量PCR(Real Time-PCR)法检测表皮生长因子(EGFm RNA)的表达;应用蛋白印迹法(Western Blot)检测各组大鼠子宫组织中核因子KB的表达。结果:1.肉眼观察正常对照组:子宫的大小及形态正常,与周围组织未发生粘连,子宫内膜未见充血水肿。盆腔炎模型组:盆腔内可见炎性渗出,子宫远端与输卵管、卵巢包裹成包块状,与周围组织有纤维样粘连,子宫肿胀、迂曲,呈积水样改变,可见宫腔积液,子宫弹性减弱,质地韧。经过中药干预后,子宫、输卵管及卵巢包块呈不同程度的缩小,子宫形态逐渐恢复至正常,其中以妇炎宁高剂量组改变最为显著,子宫远端与输卵管、卵巢粘连包块不明显,仅可见散在少量的纤维粘连,子宫积水样改变基本消失,子宫组织弹性接近正常。2.光镜下病理形态观察正常对照组:子宫粘膜层、肌层及浆膜层分层清楚,内膜腺体规整,无充血水肿,无炎性渗出;肌纤维纹理清晰;浆膜光滑,无充血、水肿及炎性渗出。盆腔炎模型组:子宫组织结构紊乱、界线不清,组织充血、水肿,病变累及内膜、肌层、浆膜层,以淋巴细胞及浆细胞为主的慢性炎细胞弥漫浸润,部分腺体囊性增生,并可见纤维组织增生。病变以内膜层尤其明显,部分模型还可见肉芽组织样改变。经过中药治疗后,各治疗组慢性炎症性改变较模型组减轻,尤其以妇炎宁高剂量组减轻明显,子宫组织结构分层较清楚,仅有极少量慢性炎细胞散在存在于内膜层,内膜腺体规整,未见纤维组织增生改变。3.ELISA检测大鼠血清中IL-8及IL-4结果大鼠血清中IL-8的含量,模型组较正常组显著升高,差异有极显著性(P0.01);经过中药干预后均呈不同程度的下降,各中药干预组与模型组比较有极显著性差异(P0.01),其中高剂量组接近正常组水平,两组比较无统计学差异(P0.05);妇炎宁中、高剂量组较康妇炎组显著降低(P0.01),妇炎宁低剂量组较康妇炎组低,但无显著性差异(P0.05)。大鼠血清中IL-4的含量,模型组较正常组显著降低(P0.01),各中药干预组均有不同程度的升高,与模型组比较具有显著性差异(P0.05或P0.01),但与正常组比较仍有显著差异(P0.01);妇炎宁低剂量、康妇炎组显著低于妇炎宁高剂量组(P0.01);妇炎宁中剂量组较康妇炎组显著升高(P0.01),妇炎宁低剂量组与康妇炎组比较,无显著性差异(P0.05)。4.ELISA检测大鼠子宫组织中ICAM-1、TGF-β结果模型组大鼠子宫组织中ICAM-1含量较正常组显著,差异有极显著性(P0.01);各中药干预组与模型组比较均呈不同程度下降,有极显著性差异(P0.01);妇炎宁高剂量组接近正常组水平,与之比较无显著性差异(P0.05);康妇炎胶囊组与妇炎宁低剂量组比较无显著性差异,与中、高剂量组有极显著性差异(P0.01)。模型组大鼠子宫组织中TGF-β的含量较正常组明显升高,两者比较具有极显著性差异(P0.01);经过中药干预后各中药治疗组明显下降,与模型组有极显著性差异(P0.01),其中妇炎宁高剂量组与正常组无显著性差异(P0.05);康妇炎组与妇炎宁低剂量组无显著性差异(P0.05)。5.RT-PCR检测大鼠子宫组织中EGFm RNA结果模型组大鼠子宫组织中EGFm RNA的表达较正常组明显升高,两者比较有极显著性差异(P0.01);经过中药干预后,妇炎宁中、高剂量组较模型组降低明显,差异具有极显著性(P0.01),其中高剂量组接近正常组水平,两者比较无显著性差异(P0.05);妇炎宁低剂量组及康妇炎组与模型组比较无显著性差异(P0.05)。6.Western Blot检测大鼠子宫组织中NF-KB结果模型组大鼠子宫组织中NF-KB的表达较正常组明显升高,两者比较具有极显著性差异(P0.01),经过中药干预后除了妇炎宁低剂量组与模型组无明显差别,其余各组均明显下降,与模型组比较有显著性差异(P0.05,P0.01),并以妇炎宁高剂量组下降最显著,接近正常组水平,两组比较无显著性差异(P0.05)。结论:1.应用混合菌注射宫腔的方法复制了慢性盆腔炎大鼠模型,模型大鼠存在子宫组织结构紊乱、界线不清,组织充血、水肿,以淋巴细胞及浆细胞为主的慢性炎细胞弥漫浸润,部分腺体囊性增生,并可见纤维组织增生的表现。2.慢性盆腔炎模型大鼠存在着免疫功能紊乱:血清中的前炎症细胞因子IL-8的含量升高;抗炎症细胞因子IL-4的含量下降;大鼠子宫组织中粘连相关的免疫因子ICAM-1、TGF-β、EGF的表达上升;大鼠子宫组织中对炎症细胞因子等具有转录功能的NF-KB表达升高。3.妇炎宁汤可促进慢性盆腔炎模型大鼠盆腔局部组织的修复,抑制炎症反应,减轻CPID大鼠子宫组织的病理损伤,使之趋于正常。4.妇炎宁汤可降低炎症细胞因子IL-8的水平,升高抗炎细胞因子IL-4的水平,使其接近正常,恢复促炎/抑炎平衡,提高抗炎能力,减轻炎症反应。5.妇炎宁汤能够降低子宫组织中与纤维粘连相关指标ICAM-1、TGF-β、EGF的表达,促进纤维蛋白的溶解,抑制纤维蛋白的沉积,缓解了组织损伤及组织慢性纤维化。6.妇炎宁汤可以通过抑制NF-KB的过度活化,使依赖其转录的多种前炎症因子转录被抑制,进而表达被下调,从而减轻由这些细胞因子介导的炎症病理损害,松解粘连。7.妇炎宁汤是治疗慢性盆腔炎的有效方剂,能通过多组分作用在多靶点,融拮抗、补充、整合、调节等多种功效而起到治疗作用,值得临床上推广应用。实验二妇炎宁汤对慢性盆腔炎(肾阳虚证)模型大鼠相关细胞因子及NF-KB的影响目的:通过观察慢性盆腔炎(肾阳虚证)模型大鼠血清、子宫组织中炎症细胞因子、粘连相关指标及核因子的变化,探讨妇炎宁汤治疗慢性盆腔炎(肾阳虚证)的免疫调节机制。材料与方法:以SD雌性大鼠为实验对象,采用混合菌液注射宫腔及肌注地塞米松的方法,复制慢性盆腔炎(肾阳虚证)病证结合的动物模型。将大鼠随机分为慢性盆腔炎(肾阳虚证)模型组、妇炎宁汤阳虚中、高剂量组及左氧氟沙星组,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组大鼠血清的炎症细胞因子水平,包括白介素-8(IL-8)、白介素-4(IL-4)。大鼠子宫形态学观察后,荧光实时定量PCR(Real Time-PCR)检测各组大鼠子宫组织中粘连相关细胞因子:细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、转化生长因子-β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)的表达。应用蛋白印迹法(Western Blot)检测各组大鼠子宫组织中NF-KB的表达。结果:1.各组大鼠行为学的表现慢性盆腔炎(肾阳虚证)模型组大鼠表现为自主活动减少、反应迟钝、喜扎堆、畏寒喜暖、体毛枯萎、便质溏稀,肛周污染。经过妇炎宁汤干预后两组大鼠行为学逐渐接近正常,但左氧氟沙星组大鼠的行为学无明显改变。2.肉眼观察慢性盆腔炎(肾阳虚证)模型组:盆腔内可见炎性渗出,子宫远端与输卵管、卵巢包裹成包块状,与周围组织有纤维样粘连更加明显,子宫肿胀、迂曲,呈积水样改变,可见宫腔积液,子宫弹性减弱,质地韧。经过妇炎宁汤干预后较模型组改善,妇炎宁高剂量组表现为:子宫远端与输卵管、卵巢粘连包块不明显,仅可见散在少量的纤维粘连,子宫积水样改变基本消失,子宫组织弹性接近正常。左氧氟沙星组较模型组无明显改善。3.光镜下病理形态观察慢性盆腔炎(肾阳虚证)模型组大鼠子宫组织结构紊乱、界线不清,组织充血、水肿,以淋巴细胞及浆细胞为主的慢性炎细胞弥漫浸润,部分腺体囊性扩张,并可见纤维组织增生。经过妇炎宁汤治疗,镜下见慢性炎症性改变均有改善,尤以肾阳虚高剂量组改善明显,可见子宫组织结构分层较清楚,仅有极少量慢性炎细胞散在存在于内膜层,内膜腺体规整,未见纤维组织增生改变。4.ELISA检测大鼠血清中IL-8及IL-4结果慢性盆腔炎(肾阳虚证)模型组大鼠血清中IL-8的含量与正常组比较,明显升高,有极显著性差异(P0.01),各治疗组与模型组比较均下降,有极显著性差异(P0.01),但妇炎宁高剂量组下降最明显,且与左氧氟沙星组比较有极显著性差异(P0.01)。模型组大鼠血清中IL-4含量较正常组明显降低,差异具有极显著性(P0.01);经过妇炎宁汤治疗后,中药各组与模型组比较明显上升,差异有极显著性(P0.01);左氧氟沙星组与模型组比较无显著性差异(P0.05);妇炎宁高剂量组与中剂量比较有极显著性差异(P0.01)。5.RT-PCR检测大鼠子宫组织中ICAM-1m RNA、TGF-βm RNA、EGFm RNA结果模型组子宫组织中ICAM-1m RNA与正常组比较显著升高,差异具有极显著性(P0.01),妇炎宁中、高剂量组与模型组比较,差异有极显著性(P0.01);高剂量组与正常组无显著性差异(P0.05);左氧氟沙星组与模型组比较无显著性差异(P0.05)。模型组子宫组织中TGF-βm RNA的表达与正常组比较显著升高,差异具有极显著性(P0.01);妇炎宁中、高剂量组与模型组比较显著下降,差异有显著性(P0.05或P0.01);左氧氟沙星组与模型组比较无显著性差异(P0.05)。大鼠子宫组织中EGFm RNA的表达,与正常组比较,模型组显著升高,差异具有极显著性(P0.01);妇炎宁汤中、高剂量组与模型组有极显著性差异(P0.01);高剂量组与正常组无显著性差异(P0.05);左氧氟沙星组与模型组比较无显著性差异((P0.05)。6.Western Blot检测大鼠子宫组织中NF-KB结果大鼠子宫组织中NF-KB的表达,模型组与正常组比较,明显升高,差异具有极显著性(P0.01);妇炎宁中、高剂量与模型组比较,明显下降,差异具有极显著性(P0.01);高剂量组与正常组无显著性差异(P0.05);左氧氟沙星组与模型组比较无显著性差异(P0.05)。结论:1.应用混合菌液注射宫腔及肌注地塞米松的方法成功复制了慢性盆腔炎(肾阳虚证)病证结合的动物模型。2.慢性盆腔炎(肾阳虚证)模型大鼠同样存在着相关细胞因子的异常表达。3.妇炎宁汤可以改善模型大鼠地塞米松所致肾阳虚证的行为学上的异常表现。4.妇炎宁汤可以通过调控相关细胞因子及核因子NF-KB的表达来调节慢性盆腔炎(肾阳虚证)模型大鼠的免疫功能,从而显著改善慢性盆腔炎组织损伤以及纤维化。5.妇炎宁汤是治疗慢性盆腔炎(肾阳虚证)的有效方剂,具有广阔的应用前景。


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