基于TLRs/MyD88/NF-κB通路探讨消瘿颗粒对EAT肝郁脾虚大鼠的影响及作用机制

【摘要】：目的:通过观察消瘿颗粒对EAT肝郁脾虚证大鼠甲状腺自身抗体、形态结构和甲功的干预作用,阐述桥本甲状腺炎肝郁脾虚证的病机实质;探讨消瘿颗粒通过调控甲状腺TLRs/MyD88/NF-κB信号通路的活化及Treg/Th17细胞平衡,发挥对EAT肝郁脾虚证大鼠的抗炎、抗凋亡作用机制。材料与方法:首先,采用动物实验的方式,观察消瘿颗粒对EAT肝郁脾虚证大鼠的干预作用,并探讨部分作用机制。SPF级雌性SD大鼠48只,适应性喂养一周后,采用随机数字法将大鼠分为两组:正常组(12只)、造模组(36只)。然后对造模组36只大鼠,采用高碘水联合甲状腺球蛋白皮下注射的方法诱导桥本甲状腺炎大鼠模型。至实验第5周,造模组大鼠增加慢性束缚应激,过度疲劳,饮食失节等复合干预因素,以此方法复制肝郁脾虚证型。至实验第8周末,通过检测血清中甲状腺自身抗体TGAb、TPOAb含量,评价桥本甲状腺炎模型。造模前后称取大鼠体重,比较各组间体重增长率;实验第8周末,进行大鼠糖水偏嗜实验,观察大鼠抑郁表现,评价肝郁脾虚证模型。将模型评价成功的大鼠再次随机分为三组:模型组(12只)、雷公藤组(11只)、消瘿颗粒组(11只)。并分别给予不同药物干预,给药周期为8周。大鼠给药剂量根据人与大鼠的体表面积等效剂量换算方法计算。正常组与模型组大鼠经口灌胃2ml蒸馏水,每日两次,连续8周;雷公藤组大鼠按照9.45mg/kg·d-1的剂量给予雷公藤多苷片经口灌胃,连续8周;消瘿颗粒组大鼠按照16.17g/kg·d-1的生药量给予消瘿颗粒经口灌胃,连续8周。治疗8周后,取大鼠腹主动脉血和甲状腺组织检测相关指标。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组大鼠血清中TGAb、TPOAb、FT3、FT4、TSH、IL-10、IL-17、IL-23水平;采用HE染色法检测甲状腺组织病理形态改变;电镜观察甲状腺超微结构;TUNEL法检测甲状腺组织细胞凋亡情况;Western blot法检测甲状腺组织Foxp3、RORγt、TLR2、TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表达水平。然后,通过对中医“瘿病”的古代文献挖掘和近代文献检索,探讨桥本甲状腺炎肝郁脾虚证的中医学及现代医学发病机制,为疏肝健脾法治疗桥本甲状腺炎提供科学的中医学及现代医学理论支持。结果:1.模型评价:与正常组比较,造模组大鼠血清甲状腺抗体TGAb、TPOAb水平均显著升高,差异有统计学意义(P0.01);与正常组比较,造模组大鼠糖水消耗率、体重增长率明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。2.一般状态:正常组大鼠外观行为等未见异常。造模组大鼠造模前期表现为易怒,束缚时强烈反抗、挣扎,解除束缚后迅速躲避、背毛竖立。造模后期,造模组大鼠从易怒逐渐出现抑郁表现,活动减少、喜扎堆拱背、对束缚反应减弱、背毛粗糙蓬松易脱落、暗黄乏泽,嗜睡,倦怠,食少,时有稀便。治疗后,雷公藤组和消瘿颗粒组大鼠上述一般情况明显改善。剔除2只未成模大鼠,故成模率为94.44%。治疗后每组取一只大鼠,检测指标前进行预实验,模型组有1只大鼠灌胃操作不当而死亡,正常组1只大鼠血标本溶血,故每组剩下10只大鼠完整标本做相应指标的检测。3.各组大鼠血清TGAb、TPOAb水平:与正常组比较,模型组、雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠血清TGAb、TPOAb水平均升高,除消瘿颗粒组大鼠血清TPOAb水平以外,差异有统计学意义(P0.01或0.05);与模型组比较,雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠血清TGAb、TPOAb水平降低,差异有统计学意义(P0.01);与雷公藤组比较,消瘿颗粒组大鼠血清TGAb、TPOAb水平降低,差异有统计学意义(P0.01)。4.各组大鼠血清FT3、FT4、TSH水平:与正常组比较,模型组、雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠血清FT3、FT4水平均降低(P0.01或0.05),TSH水平升高(P0.01),差异有统计学意义;与模型组比较,雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠血清FT3、FT4水平升高,TSH水平降低,差异有统计学意义(P0.01);与雷公藤组比较,消瘿颗粒组大鼠血清FT3、FT4水平升高,TSH水平降降低,差异有统计学意义(P0.01)。5.各组大鼠甲状腺组织病理形态变化:正常组甲状腺结构完整,形态规则,滤泡大小及形态较均匀一致,间质无明显淋巴细胞浸润;模型组甲状腺组织结构破坏,部分滤泡扩大,部分滤泡萎缩,滤泡腔内及间质组织中可见大量淋巴细胞浸润,伴随间质纤维化;雷公藤组甲状腺部分滤泡扩大,部分滤泡萎缩,滤泡腔内及间质组织中淋巴细胞浸润减少,纤维化程度减轻;消瘿颗粒组甲状腺病理形态特点与雷公藤组类似,滤泡腔内及间质中淋巴细胞浸润数量减少,无明显纤维化形成。6.电镜下甲状腺超微结构改变:正常组细胞大小适中,胞膜规整,游离面微绒毛稀疏,细胞核呈圆形,核膜清晰完整,胞质呈匀质状,内有丰富的细胞器,粗面内质网清晰可辨,未见凋亡小体;模型组胞体皱缩,胞膜不规则,游离面微绒毛增多、不整齐,细胞核固缩、核膜不规则或破裂,胞质内细胞器减少,内质网高度扩张水肿,线粒体明显减少,部分线粒体嵴消失,可见有凋亡小体形成;雷公藤组胞体肿胀,胞膜较规整,游离面微绒毛较规则,胞核呈椭圆形,核膜较厚、完整清晰,胞质内出现大小不等的空泡,部分细胞器溶解,内质网明显肿胀,未见凋亡小体;消瘿颗粒组胞体略肿胀,胞膜较规整,游离面微绒毛少而规则,细胞核呈圆形或椭圆形,核膜完整,胞质内细胞器略减少,见少量空泡,内质网轻度扩张,与模型组相比,形态结构趋于正常,未见凋亡小体。7.各组大鼠甲状腺组织细胞凋亡数:与正常组比较,模型组、雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠甲状腺组织细胞凋亡数升高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠甲状腺组织细胞凋亡数降低,差异有统计学意义(P0.01);与雷公藤组比较,消瘿颗粒组大鼠甲状腺组织细胞凋亡数略升高,而两组比较无统计学意义。8.各组大鼠甲状腺组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表达水平:与正常组比较,模型组、雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠甲状腺组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠甲状腺组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P0.01);与雷公藤组比较,消瘿颗粒组大鼠甲状腺组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表达水平升高,但无统计学意义。9.各组大鼠血清IL-10、IL-17、IL-23水平:与正常组比较,模型组、雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠血清IL-10水平均降低,IL-17、IL-23水平均显著升高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠血清IL-10水平升高(P0.01或0.05),IL-17、IL-23水平降低(P0.01),差异有统计学意义;与雷公藤组比较,消瘿颗粒组大鼠血清IL-10水平升高(P0.01),IL-17、IL-23水平降低(P0.01),差异有统计学意义。10.各组大鼠甲状腺组织Foxp3、RORγt蛋白表达:与正常组比较,模型组、雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠甲状腺组织Foxp3蛋白表达降低,RORγt蛋白表达升高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,雷公藤组、消瘿颗粒组大鼠甲状腺组织Foxp3蛋白表达升高,RORγt蛋白表达降低,差异有统计学意义(P0.01);与雷公藤组比较,消瘿颗粒组大鼠甲状腺组织Foxp3蛋白表达升高,RORγt蛋白表达降低,但无统计学意义。结论:1.高碘水联合甲状腺球蛋白皮下注射诱导桥本甲状腺炎大鼠模型后,附加慢性束缚、过度疲劳、饮食失节等复合干预因素,能够成功建立EAT肝郁脾虚病证结合大鼠模型,能够较好地模拟临床桥本甲状腺炎肝郁脾虚证的病症特点。2.消瘿颗粒通过降低甲状腺自身抗体、减轻甲状腺组织病理及超微结构损伤、减轻甲减,对EAT肝郁脾虚模型大鼠起到了治疗作用。3.消瘿颗粒通过抑制TLRs/MyD88/NF-κB信号通路的异常活化,从而减轻了EAT肝郁脾虚模型大鼠的甲状腺细胞凋亡;升高血清IL-10水平,降低血清IL-17、IL-23水平,起到抗炎作用。4.消瘿颗粒亦通过调节Treg/Th17平衡紊乱,从而发挥抑制桥本甲状腺炎模型大鼠的炎症反应作用。