双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注大鼠NF-κB信号通路影响的实验研究

【摘要】：目的:本研究通过在体实验观察双参通脉颗粒(Ginseng and Salvia Miltiorrhiza Granules,GSG)对心肌缺血再灌注(Myocardial infarction Ischemia reperfusion injury,MIRI)大鼠心功能的保护作用、对NF-κB信号通路的作用,通过离体细胞实验,观察双参通脉颗粒含药血清对乳大鼠心肌细胞缺氧复氧模型NF-κB信号通路的作用,探讨双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注损伤的调节作用及机制,为临床用药提供理论支持。材料与方法:在体实验:SPF级12周龄SD大鼠50只,雌雄各半,质量(230±20)g。将50只SD大鼠随机分成5组,每组10只,分别为假手术组,模型组,西药组,中药低剂量组,中药高剂量组。按人体与大鼠体表面积换算药物剂量,低、高剂量分别相当于生药量7.31g/kg,13.45g/kg,西药合心爽用量4.23mg/kg。假手术组及模型组应用等量生理盐水,以上各组按2次/日,3ml/次,连续灌胃四周。心电图评估筛查后,结扎大鼠左冠状动脉前降支造模,缺血30min,再灌注120min,手术全程监测心电图判定造模是否成功,监测心功能。术后大鼠经腹主动脉取血,分离血清,ELISA法检测心肌组织氧化损伤指标谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、内皮素(ET)、髓过氧化物酶(MPO)含量变化,炎症介质白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-ɑ)含量变化;免疫组化法检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)含量变化;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色评估心肌细胞凋亡指数;Western blot检测心肌核转录因子-κB(NF-κB)、IκBα蛋白表达;同时观察各组大鼠心肌组织病理变化。离体实验:双参通脉颗粒含药血清的制备:30只SD大鼠,饲养于适宜环境中,自由饮水,进食,温度,湿度适宜,适应性喂养3天,后分组,随机分成三组,正常组10只,双参通脉颗粒低、高剂量组各10只,中药予浓度为7.31g/kg、13.45g/kg的颗粒剂水溶液,日两次灌胃,3ml/次,日两次,连续2周,正常组给予等量盐水,中药各组持续灌胃5d后取血,离心,取上清,过滤灭菌,-80℃冻存备用。细胞培养及传代:大鼠心肌细胞株接种于培养基,置于温度37℃,5%CO_2培养箱内24h,传代。细胞造模:建立心肌细胞缺氧复氧模型,细胞分四组,正常组、模型组、中药低、高剂量组。正常组在37℃,5%CO_2培养基中加入与含药血清同浓度的正常大鼠血清,连续培养24h;模型组心肌细胞置培养箱(37℃,5%CO_2,90%N_2,5%O_2)缺氧6h,后置于37℃,5%CO_2培养基复氧12h,结束;中药低、高剂量组细胞培养液中加入最佳工作浓度的中药含药血清(过滤除菌,4℃保存,稀释到适当浓度约1000倍),其余同模型组。分别取各组细胞培养瓶中培养液,按照LDH检测试剂盒说明书,通过比色法检测各组细胞培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性;CCK-8法检测心肌细胞活性;将培养好的心肌细胞以适当密度接种于96孔板中,每组设置6个复孔,加入培养液,CCK-8,与未加细胞孔对比,放置培养箱4-5小时,完成后,用酶标仪于450nm处检测OD值,Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;ELISA法检测各组细胞培养基上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α含量变化,将各组心肌细胞按照上述实验方法加入含药学清及试剂后,按照ELISA试剂盒说明书操作;免疫荧光染色观察NF-κB、IκBα、Iκκβ的表达。采用SPSS17.0软件对所得实验数据进行处理分析,以均数±标准差(mean±SD)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用q检验,凋亡率采用卡方检验(Chi-square test),以p0.05为具有统计学差异。结果:1双参通脉颗粒(GSG)对心肌缺血再灌注(MIRI)大鼠心功能的影响1.1 GSG对各组大鼠血流动力学的影响与模型组相比,GSG各组反映左心室收缩功能的指标(LVSP)显著升高(p0.05),左室最大上升速率(+dp/dtmax)升高(p0.05),反映左心室舒张功能的指标(LVDP)显著降低(p0.05),左室最大下降速率(-dp/dtmax)降低(p0.05),GSG低、高剂量组及西药组心率变化(D-value)均较模型组小(p0.05)。1.2 GSG对MIRI大鼠血清GSH-PX、CAT、ET、MPO含量的影响GSG干预后,ET、MPO均有所下降,GSH-PX、CAT含量上升,与模型组比较有显著性差异(p0.05),与假手术组比较,模型组心肌细胞凋亡指数显著升高(p0.05),西药组及GSG低、高剂量组心肌细胞凋亡指数明显下降(p0.05)。1.3 GSG对MIRI大鼠心肌组织病理变化的影响假手术组心肌纤维排列较紧密规整,组织间隙水肿较轻微,仅有轻度淤血,周围组织有微量渗出,血管轻度扩张。模型组心肌纤维扭曲断裂,细胞肿胀,组织间隙水肿,细胞核散乱无序,心肌细胞肥大,染色疏松。西药组心肌纤维断裂较少,排列紊乱,心肌间质疏松,心肌间隙血管扩张,周围可见水肿及渗出。中药低剂量组心肌纤维排列较MIRI组规整,组织间隙有水肿渗出,炎细胞浸润。中药高剂量组心肌纤维排列较规整,肌纤维断裂少,组织间隙水肿较轻。2双参通脉颗粒对MIRI大鼠NF-κB信号通路的影响2.1 GSG对血清炎症介质IL-1β、IL-6和TNF-ɑ含量的影响假手术组血清IL-1β、IL-6和TNF-ɑ含量水平升高不明显,模型组IL-1β、IL-6和TNF-ɑ含量增加(p0.05),与模型组比较,中药低、高剂量组IL-1β、IL-6和TNF-ɑ含量均显著下降(p0.05)。2.2 GSG对心肌组织VCAM-1、ICAM-1含量变化的影响假手术组心肌组织可见微少的被染色的细胞;模型组心肌组织被染色的细胞较多,较密集;西药组染色细胞较模型组减少;中药低剂量组染色细胞较模型组减少;中药高剂量组染色细胞最少。ICAM-1含量变化:假手术组心肌组织可见微小的染色组织;模型组心肌组织被染色部位较大,较密集;西药组染色组织较模型组减少;中药低剂量组染色组织较模型组减少;高剂量组染色组织最少。2.3 GSG对大鼠心肌细胞凋亡率的影响假手术组心肌细胞凋亡率为6.12%,模型组心肌细胞凋亡率为32.01%,与假手术组比较有显著差异(p0.05);西药组凋亡细胞较模型组减少,25.32%;中药低剂量组细胞凋亡率为7.31%,与模型组比较有显著差异(p0.05);中药高剂量组细胞凋亡率为13.45%,与模型组比较有显著差异(p0.05)。2.4 GSG对MIRI大鼠NF-κB、IκBα蛋白表达的影响与假手术组比较,模型组NF-κB蛋白表达显著升高(p0.05),IκBα蛋白表达显著降低(p0.05),给予GSG后,GSG低、高剂量组NF-κB蛋白表达均显著降低(p0.05),IκBα蛋白表达显著升高(p0.05)。3双参通脉颗粒含药血清对乳大鼠心肌细胞NF-κB信号通路的影响3.1各组细胞培养液LDH活性改变正常组心肌细胞生长状态良好,心肌细胞培养液LDH活性为93.47U/L,模型组心肌细胞培养液LDH活性为241.54U/L,与正常组比较显著升高(P0.05);GSG低剂量组心肌细胞培养液LDH活性为175.02U/L,与模型组比较显著降低(P0.05),GSG高剂量组心肌细胞培养液LDH活性为142.77U/L,与模型组比较显著降低(P0.05)。3.2各组心肌细胞存活率改变正常组心肌细胞存活率为80.65%;模型组心肌细胞存活率42.14%;与正常组相比明显降低(p0.05);中药低剂量组心肌细胞存活率为58.32%;与模型组相比显著升高(p0.05);高剂量组心肌细胞凋亡率为60.41%,与模型组比较均有显著性差异(p0.05)。3.3各组心肌细胞凋亡率改变经Annexin V与PI染色后用流式细胞仪进行检测,正常组心肌细胞凋亡率为2.84%,模型组心肌细胞凋亡率为26.62%,与正常组比较有显著性差异(p0.05);中药血清低剂量组心肌细胞凋亡率为14.38%,高剂量组心肌细胞凋亡率为6.16%,与模型组比较均有显著性差异(p0.05)。采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡,正常组心肌细胞凋亡率为42.82%,模型组心肌细胞凋亡率值为83.71%,与模型组比较有显著性差异(P0.05);中药血清低剂量组心肌细胞AI值为54.21%,与模型组比较有显著性差异(P0.05),高剂量组心肌细胞凋亡率值为62.94%,与模型组比较有显著性差异(P0.05)。3.4各组心肌细胞培养基上清IL-1β、IL-6和TNF-α含量改变与正常组比较,模型组心肌细胞培养基中IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著增高(P0.05),与模型组比较,中药血清组IL-1β、IL-6和TNF-α含量均显著降低(P0.05)。3.5各组心肌细胞内蛋白激酶NF-κB、IκBα、Iκκβ表达改变与正常组比较,模型组心肌细胞绿色荧光强度显著升高,表明NF-κB蛋白激酶表达量增加(P0.05),提示NF-κB含量增高;与模型组比较,中药血清处理组绿色荧光强度降低,说明中药GSG含药血清对NF-κB、Iκκβ有抑制作用;对IκBα有增加作用;中药组能降低NF-κB、Iκκβ蛋白激酶表达水平(P0.05),升高IκBα蛋白激酶表达水平(P0.05)。结论:1双参通脉颗粒可以保护缺血再灌注大鼠的心功能,提高各项心功能指标,降低心律失常发生率,减轻心肌细胞氧化损伤。2双参通脉颗粒可以降低NF-κB信号转导通路中的关键炎症介质IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,降低蛋白激酶NF-κB、Iκκβ的表达,升高抑制凋亡蛋白IκBα的表达,降低心肌细胞凋亡率。3双参通脉颗粒含药血清可以降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,降低蛋白激酶NF-κB、Iκκβ的含量,升高蛋白激酶IκBα的含量,从而提高大鼠缺氧复氧心肌细胞的存活率,抑制凋亡率。