补肾益气活血组方调控WNT信号通路治疗慢性心力衰竭大鼠的生物学机制

【摘要】：目的:以“肾藏精起亟”理论为指导,通过建立慢性心衰大鼠模型,重点研究补肾益气活血组方和赖诺普利对慢性心衰大鼠血清中Wnt信号通路配体和拮抗因子表达水平的影响,以及对慢性心衰大鼠心肌组织中Wnt信号通路关键蛋白水平和活性的影响,从而探究补肾益气活血组方治疗慢性心衰的生物学机制与Wnt信号通路之间的联系。材料与方法:1.100只大鼠随机选取20只作为空白组,剩余80只大鼠进行冠状动脉结扎手术:腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,经口行气管插管,迅速连接小动物呼吸机。应用心电图机观察并记录大鼠心电图。术区备皮及消毒,于左胸第3~4肋间开胸,逐层切开皮肤、胸大肌,暴露肋骨,利用开胸器扩胸后,于左冠状动脉前降支起点下2~3mm用缝线结扎。心脏表面予以利多卡因注射液防止发生室性心律失常。闭合胸腔,逐层关胸。心电图显示ST段明显抬高判定为心肌梗死,表明结扎成功。观察大鼠恢复自主呼吸并呼吸平缓后,拔出气管插管针。术后每天1次,连续3天注射青霉素钠4万单位/只。术后存活大鼠常规喂养1周后,采取半量饲料饥饿喂养,同时每天力竭式游泳1次,时间随大鼠状态逐步缩短,持续4周。训练期间模型大鼠出现精神萎靡、活动度减低、脱毛、喉间哮鸣音等体征,并通过心脏超声检测左室射血分数45%列入慢性心力衰竭的下一步实验对象。2.由于灌胃给药期间模型组和治疗组大鼠出现不同程度的死亡,在后期的实验中每组大鼠采用随机数字表法各取12只进行检测。大鼠持续给药28天后,经过禁食不禁水处理12h后,麻醉处死全部大鼠。通过腹主动脉取血,离心后收集上清液。3.利用酶联免疫法对各组大鼠血清中NT-proBNP和cTnI水平进行检测,观察各组大鼠间血清中NT-proBNP和cTnI的变化趋势。4.利用酶联免疫法对各组大鼠血清中经典Wnt信号通路配体Wnt3a水平、非经典Wnt信号通路配体Wnt5a和Wnt11水平进行检测,观察各组大鼠间血清中Wnt信号通路配体的变化趋势。以及利用酶联免疫法对各组大鼠血清中Wnt信号通路拮抗因子DKK1、sFRP1和WIF1水平进行检测,观察各组大鼠间血清中Wnt信号通路拮抗因子的变化趋势。5.利用免疫印迹分析对各组大鼠心肌组织中Wnt信号通路关键蛋白Dvl3蛋白水平、GSK3β蛋白Ser9位点磷酸化水平、β-catenin蛋白水平进行检测,分析慢性心衰大鼠和不同药物治疗后慢性心衰大鼠的Wnt信号通路关键蛋白水平或活性的变化趋势。结果:1.各组大鼠血清中NT-proBNP和cTnI表达水平1.1各组大鼠血清中NT-proBNP的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠血清中NT-proBNP水平显著升高(P0.01);西药组、中药组分别与空白组比较,血清中NT-proBNP水平亦明显升高,均具有统计学意义(P0.01),表明慢性心力衰竭时NT-proBNP水平呈增高趋势。同时西药组、中药组分别与模型组比较,大鼠血清中NT-proBNP水平均显著降低,具有统计学意义(P0.01),而中药组与西药组组间比较血清中NT-proBNP水平则没有统计学差异(P0.05)。1.2各组大鼠血清中cTnI的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠血清中cTnI水平显著升高(P0.01);西药组、中药组分别与空白组比较,血清中cTnI水平亦明显升高,均具有统计学意义(P0.01),表明慢性心力衰竭时cTnI水平呈增高趋势。同时西药组、中药组分别与模型组比较,大鼠血清中cTnI水平均显著降低,具有统计学意义(P0.01),而中药组与西药组组间比较血清中cTnI水平则没有统计学差异(P0.05)。2.各组大鼠血清中Wnt信号通路配体和拮抗因子的表达水平2.1各组大鼠血清中经典Wnt信号通路配体Wnt3a的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠血清中Wnt3a的水平明显下降,具有统计学意义(P0.01);与模型组比较,西药组大鼠血清中Wnt3a水平有所回升,而中药组大鼠血清中Wnt3a水平也显著回升,均具有统计学意义(P0.01);与西药组比较,中药组大鼠血清中Wnt3a水平显著高于西药组大鼠,组间差异有统计学意义(P0.01)。2.2各组大鼠血清中非经典Wnt信号通路配体Wnt5a和Wnt11的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠血清中Wnt5a和Wnt11的水平均明显降低,具有统计学意义(P0.01);与模型组比较,西药组大鼠血清中Wnt5a和Wnt11水平均有所上升,中药组大鼠血清中Wnt5a和Wnt11水平也均显著上升,均具有统计学意义(P0.01);与西药组比较,中药组大鼠血清中Wnt5a和Wnt11水平显著高于西药组大鼠,组间差异有统计学意义(P0.01)。2.3各组大鼠血清中Wnt信号通路拮抗因子DKK1、sFRP1、WIF1的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠血清中Wnt信号拮抗因子DKK1、sFRP1和WIF1蛋白水平均明显升高,具有统计学意义(P0.01);与模型组比较,西药组大鼠和中药组大鼠血清中DKK1、sFRP1和WIF1蛋白水平都显著下降,均具有统计学意义(P0.01);而与西药组相比,中药组大鼠血清中DKK1、sFRP1和WIF1蛋白水平下降的更加明显,组间差异均有统计学意义(P0.01)。2.4慢性心衰大鼠血清中Wnt信号通路配体水平显著降低、拮抗因子水平显著上升;使用补肾益气活血组方和赖诺普利治疗后慢性心衰大鼠血清中Wnt信号通路配体水平回升、拮抗因子水平下降,而补肾益气活血组方对Wnt信号配体和拮抗因子的调控程度均显著高于赖诺普利。3.各组大鼠心肌组织中Wnt信号通路关键蛋白的表达水平3.1各组大鼠心肌组织中Dvl3蛋白的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠心肌组织中Dvl3蛋白水平显著升高,具有统计学意义(P0.01);与模型组比较,西药组大鼠和中药组大鼠心肌组织中Dvl3蛋白水平则显著下降,具有统计学意义(P0.01);与西药组相比,中药组大鼠心肌组织中Dvl3蛋白水平下降更明显,组间差异具有统计学意义(P0.01)。3.2各组大鼠心肌组织中磷酸化GSK3β蛋白的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠心肌组织中GSK3β蛋白Ser9位点磷酸化水平显著升高,具有统计学意义(P0.01);与模型组比较,西药组大鼠和中药组大鼠心肌组织中GSK3β蛋白Ser9位点磷酸化水平则明显下降,具有统计学意义(P0.01);与西药组比较,中药组大鼠心肌组织中GSK3β蛋白Ser9位点磷酸化水平下降更明显,组间差异具有统计学意义(P0.01)。3.3各组大鼠心肌组织中β-catenin蛋白的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠心肌组织中β-catenin蛋白水平显著升高,具有统计学意义(P0.01);与模型组比较,西药组大鼠心肌组织中β-catenin蛋白水平则无明显下降,组间差异无统计学意义(P0.05),而与模型组比较中药组大鼠心肌组织中β-catenin蛋白水平则显著下降,具有统计学意义(P0.01);与西药组比较,中药组大鼠心肌组织中β-catenin蛋白水平明显下降,组间差异具有统计学意义(P0.01)。3.4补肾益气活血组方对Dvl3蛋白表达水平影响最为显著,而对GSK3β蛋白Ser9位点磷酸化水平影响次之,对β-catenin蛋白水平影响又次之,表明补肾益气活血组方可能主要在Dvl蛋白水平发挥直接调控作用;赖诺普利虽可下调Dvl3蛋白水平和GSK3β蛋白Ser9位点磷酸化水平,但对Wnt信号通路核心蛋白β-catenin表达水平则没有作用,表明赖诺普利很可能通过间接调控作用影响了Dvl水平和GSK3β活性。结论:1.通过冠状动脉结扎术及饥饿配合力竭式游泳方法建立慢性心衰大鼠模型,发现NT-proBNP和cTnI可作为慢性心衰诊断和治疗效果评估的指标,补肾益气活血组方对慢性心衰的治疗效果与西药赖诺普利相当。2.慢性心衰大鼠血清中经典和非经典Wnt信号通路配体水平均明显下降,表明经典和非经典Wnt信号通路均参与慢性心力衰竭病理过程。补肾益气活血组方可能直接调控经典和非经典Wnt信号通路活性发挥治疗慢性心衰的作用,而赖诺普利则可能通过间接作用影响经典和非经典Wnt信号通路发挥治疗慢性心衰的作用。3.补肾益气活血组方可显著下调慢性心衰大鼠血清中Wnt信号通路拮抗因子DKK1、sFRP1和WIF1蛋白水平,表明补肾益气活血组方可通过调控Wnt信号通路拮抗因子表达发挥治疗慢性心力衰竭的作用。4.补肾益气活血组方显著降低慢性心衰大鼠心肌组织中Wnt信号通路关键蛋白Dvl3蛋白、GSK3β蛋白Ser9位点磷酸化及β-catenin蛋白水平,且对Dvl3调控效果显著强于p-GSK3β和β-catenin,表明补肾益气活血组方可能直接参与调控经典Wnt信号通路,并在Dvl、GSK3β和β-catenin蛋白等多个层面发挥作用,且主要调控Dvl蛋白水平。赖诺普利仅部分影响Dvl3和p-GSK3β蛋白水平,而对β-catenin蛋白水平没有调控作用,表明补肾益气活血组方对调控经典Wnt信号通路具有特异性,而赖诺普利对经典Wnt信号通路的影响可能是间接的。