基于Nrf2/HO-1通路探讨益脉颗粒对高脂合并MIRI大鼠心肌损伤的影响及机制

【摘要】：目的:通过构建高脂合并心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠模型,探讨益脉颗粒对高脂合并MIRI的保护作用。以Nrf2/HO-1通路介导的炎症、氧化应激、细胞凋亡为切入点,旨在揭示益脉颗粒对高脂合并MIRI的保护作用以及分子机制。材料与方法:1.益脉颗粒对高脂合并MIRI大鼠心肌损伤的保护作用(1)将100只大鼠随机分5组,分别为假手术组、模型组、益脉颗粒高、中、低剂量组,每组20只。假手术组动物常规饲养,其余各组给予高脂饲料喂养2周,其他条件相同。假手术组、模型组大鼠每日灌服生理盐水10ml/kg,益脉颗粒低、中、高剂量组每日灌服中药煎液10ml/kg,灌胃次数为日2次,MIRI造模前连续给药1周。各组大鼠心肌缺血30分钟再灌注2小时后,原位结扎冠状动脉左前降支,快速取出心脏,生理盐水冲洗,冻存于-20℃,后进行心肌梗死面积测定。同时大鼠腹主动脉进行取血,后分离血清备用。心肌梗死面积测定取材剩余的心脏组织冻存于-80℃超低温冰箱中备用。(2)全自动生化分析仪检测各组大鼠血清血脂水平(TG、TC、HDL-C及LDL-C)。(3)紫外分光光度计检测各组大鼠血清心肌酶谱水平(CK、CK-MB、HBDH及LDH)。(4)TTC法检测各组大鼠心肌梗死面积。(5)HE染色检测各组大鼠心脏组织形态学变化。(6)分析各组大鼠心电图ST段及T波变化。2.益脉颗粒对高脂合并MIRI大鼠心肌相关炎症因子的影响(1)造模及分组同上。(2)ELISA法检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。(3)RT-qPCR法检测大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达。(4)Western blot法测定各组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白表达。3.益脉颗粒通过Nrf2/HO-1通路影响高脂合并MIRI大鼠的氧化应激和细胞凋亡(1)造模及分组同上。(2)荧光探针法测定各组大鼠心肌组织中ROS的活性。(3)ELISA法测定各组大鼠血清中MDA、SOD、GSH-px的活性。(4)RT-qPCR法检测大鼠心肌组织中Nrf2、HO-1 mRNA的表达。(5)Western blot法测定各组大鼠心肌Bax、Bcl-2、Caspase3、Nrf2及HO-1蛋白的表达。结果:1.血清血脂水平检测表明,与模型组比较,益脉颗粒高剂量组可显著降低大鼠血清TG,TC,LDL-C水平,显著升高HDL-C水平(与模型组比较,P0.01)。2.血清心肌酶谱水平检测表明,益脉颗粒高剂量组可显著降低大鼠血清CK、CK-MB、HBDH、LDH水平(与模型组比较,P0.01)。3.HE染色显示,益脉颗粒高剂量组只有少量坏死区域,心肌纤维排列较整齐,心肌细胞间质仅有少量炎性细胞浸润,结构清晰,能够显著改善心肌组织MIRI损伤的病理学改变。4.心肌梗死面积检测发现,益脉颗粒高剂量组能够明显减少大鼠心肌梗死面积(与模型组比较,P0.01)。5.心电图结果分析表明,益脉颗粒高剂量可显著回降MIRI大鼠升高的ST段及T波水平(与模型组比较,P0.01)。6.ELISA检测结果显示,益脉颗粒高剂量组能够显著降低MIRI大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平(与模型组比较,P0.01)。7.RT-qPCR法检测结果示,益脉颗粒高剂量组能够显著降低大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表达(与模型组比较,P0.01)。8.Western blot检测结果示,益脉颗粒高剂量组能够显著降低大鼠心肌组织中NF-κB蛋白表达水平(与模型组比较,P0.01)。9.荧光探针法检测ROS结果示,益脉颗粒高剂量组能够显著下调ROS水平(与模型组比较,P0.01)。10.ELISA检测结果示,益脉颗粒高剂量组能够显著升高大鼠血清SOD、GSH-px水平,显著降低MDA水平(与模型组比较,P0.01)。11.Western blot检测结果示,益脉颗粒高剂量组可显著升高大鼠心肌组织Bcl-2水平,显著降低Bax、Caspase3水平(与模型组比较,P0.01)。12.Western blot检测结果示,益脉颗粒高剂量组可显著提高大鼠心肌组织Nrf2、HO-1蛋白的表达水平(与模型组比较,P0.01)。13.RT-qPCR法检测结果示,益脉颗粒高剂量组能够显著提高大鼠心肌组织Nrf2、HO-1mRNA的表达水平(与模型组比较,P0.01)。结论:1.益脉颗粒可以起到改善高脂合并心肌缺血再灌注损伤模型大鼠的血脂紊乱及减轻心肌缺血再灌注损伤的作用。2.益脉颗粒可以通过减轻炎症反应、抗氧化应激及抑制细胞凋亡来改善心肌缺血再灌注损伤,起到保护心肌的作用。3.益脉颗粒可以通过调控Nrf2/HO-1通路进而抑制氧化应激和细胞凋亡改善心肌缺血再灌注损伤。