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黄龙汤联合美罗培南对CLP模型大鼠抗炎作用机制研究

赵妍  
【摘要】:目的:观察黄龙汤联合美罗培南对脓毒症模型大鼠的抗炎作用,通过对各组大鼠近回盲部回肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平的检测,探讨黄龙汤联合美罗培南对脓毒症大鼠回肠TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路的调控作用,阐述黄龙汤联合美罗培南对脓毒症模型大鼠的抗炎作用机制。材料与方法:雄性SPF级SD大白鼠70只,200±20g,购自辽宁长生生物科技有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(辽)2010-0001。实验动物购入后,饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物室内,许可证号:SYXK(辽)2013-0009。常规颗粒饲料喂养,自由食水,12小时昼夜节律。大鼠购入后,适应性饲养一周,观察其状态良好,对周围环境完全熟悉,活动度良好后,开始正式实验。黄龙汤中药饮片,购自辽宁中医药大学附属医院药局。注射用美罗培南,石药集团中诺药业(石家庄)有限公司生产。70只大鼠,随机抽取10只作为假手术组,剩余60只行盲肠结扎穿孔术,模型复制后,再次随机分为模型对照组,西药组,黄龙汤联合西药组,共计四组。大鼠称量体重后,经腹腔注射10%水合氯醛溶液,3ml/kg体重,待大鼠深度麻醉后,左侧腹部平3-4腰椎旁开0.8cm处剪毛,俯卧位固定于手术台,去毛处碘伏常规消毒后,纵向切口1cm,逐层钝性分离,直至腹腔,组织镊探查,找到盲肠尖,小心移至切口处,距离盲肠尖1cm处结扎盲肠,并于盲肠尖部以7号针头不重复刺穿盲肠3次,挤压盲肠,另少许盲肠内容物溢出,盲肠归位,逐层缝合肌层及皮肤层,碘伏消毒。假手术组大鼠术式同上,但不做盲肠结扎和穿孔。术后24小时,于假手术大鼠和盲肠结扎穿孔术大鼠中各随机抽取2只,断髓处死,取近回盲部3cm处的回肠组织,浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定,次日取出制备石蜡切片,HE染色法观察回肠病理改变,判断模型是否复制成功。假手术组:正常饲养,不作处理。术后次日,模型复制成功后,假手术组大鼠正常饲养,不做处理;模型对照组大鼠经口灌胃蒸馏水,2ml/次·只~(-1),同时经腹腔注射生理盐水,1ml/次·只~(-1),每日2次,连续4天;西药组大鼠经腹腔注射美罗培南注射液,1ml/次·只~(-1),每日2次,连续4天;黄龙汤联合西药组大鼠经口灌胃黄龙汤,2ml/次·只~(-1),同时经腹腔注射美罗培南注射液,1ml/次·只~(-1),每日2次,连续4天。末次给药后1小时,将大鼠以10%水合氯醛经腹腔注射麻醉,剖开腹腔,腹主动脉穿刺采集全血5ml至促凝管中,室温静置1小时,2000转/分,离心10分钟,分离上清液用于检测IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量。各组大鼠取血后,于近回盲部3cm处截取回肠组织2cm,预冷PBS缓冲液洗净后,冻存于2ml冻存管中,用于检测回肠组织中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量和TLR4、MyD88、NF-κB的表达水平。另取回肠组织2cm,浸泡于4%多聚甲醛溶液中,用于免疫组织化学法检测回肠组织中PI3K、Akt、p-Akt的表达水平。自CLP模型复制后,每日观察大鼠一般状态,末次给药后,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组大鼠血清、回肠组织中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量;采用western-blot法检测回肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB的表达水平;采用免疫组织化学法检测回肠组织中PI3K、Akt、p-Akt的表达水平。结果:1.模型评价:假手术组CLP术后大鼠近回盲部回肠组织HE染色结果显示:假手术组大鼠黏膜层完好,尤其是上皮层,未见受损改变,黏膜下层未见炎性细胞浸润情况。CLP术大鼠回肠HE染色镜下可见上皮层变性、脱落,肠绒毛排列紊乱,甚至发生融解或缺失,黏膜下层有大量的炎性细胞浸润,浆膜层也可见炎性细胞,偶见坏死灶一般状态观察2.一般状态观察:CLP术后,意外死亡3只,完全苏醒后,饲养至次日,期间死亡12只,次日随机抽取2只进行模型评价,剩余CLP术后大鼠43只,随机分为三组,模型对照组15只,西药组14只,黄龙汤联合西药组14只。干预期间,模型对照组大鼠死亡7只,西药组死亡6只,黄龙汤联合西药组死亡5只。假手术组未见死亡,随机抽取2只进行模型评价。末次给药后,假手术组大鼠伤口愈合良好,毛色洁白,富有光泽,活动度良好,食水量正常。模型对照组大鼠状态最差,毛色枯槁,蜷缩聚堆于鼠笼角落,活动度极少,进水进食量急剧减少。西药组和黄龙汤联合西药组大鼠状态明显好于模型对照组,未见大鼠聚堆现象,但活动度明显较假手术组差,伤口愈合情况尚可。3.各组大鼠血清及回肠组织中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量检测结果显示:与假手术组比较,其余三组大鼠血清及回肠组织中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量均显著升高(p0.01),有统计学差异;与模型对照组比较,西药组和黄龙汤联合西药组大鼠血清及回肠组织IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量均显著降低(p0.01),有统计学差异;与西药组比较,黄龙汤联合西药组大鼠血清及回肠组织IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量均显著降低(p0.01),有统计学差异。4.各组大鼠回肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB表达水平检测结果显示:与假手术组比较,模型对照组大鼠回肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB表达水平显著上调,有统计学差异(p0.01);与模型对照组比较,西药组、黄龙汤联合西药组大鼠回肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB表达水平显著下调,有统计学差异(p0.01);与西药组比较,黄龙汤联合西药组大鼠回肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB表达水平显著下调,有统计学差异(p0.01)。5.各组大鼠回肠组织中PI3K、Akt、p-Akt表达水平检测结果显示:与假手术组比较,模型对照组大鼠回肠组织中PI3K、Akt、p-Akt表达水平显著上调,有统计学差异(p0.01);与模型对照组比较,西药组、黄龙汤联合西药组大鼠回肠组织中PI3K、Akt、p-Akt表达水平显著下调,有统计学差异(p0.01);与西药组比较,黄龙汤联合西药组大鼠回肠组织中PI3K、Akt、p-Akt表达水平显著下调,有统计学差异(p0.01)。结论:1.大鼠盲肠穿孔术能够引发全身较为严重的炎症反应,与临床脓毒症的发生过程及其相似,可用于脓毒症发病机制及药物疗效观察等相关研究对象。2.黄龙汤联合美罗培南对CLP模型大鼠血清及回肠组织中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8的含量。3.黄龙汤联合美罗培南对CLP模型大鼠的抗炎作用可能通过抑制血清及感染灶局部IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8的水平而实现的。4.黄龙汤联合美罗培南能够下调脓毒症模型大鼠回肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平。5.黄龙汤联合美罗培南对脓毒症模型大鼠的抗炎作用可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的过度活化而实现的。6.黄龙汤联合美罗培南能够下调脓毒症模型大鼠回肠组织中PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平。7.黄龙汤联合美罗培南对脓毒症模型大鼠的抗炎作用可能是通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路的活化而实现的。


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