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深刺环跳穴对坐骨神经卡压损伤模型大鼠背根神经节差异基因表达的影响

白增华  
【摘要】:目的:本实验旨在为临床毫针治疗技术中,浅深不同针法的选择提供明确的实验依据。具体地,有两个实验目标。首先,以对照研究的方法,在相同的穴位、相同的进针角度及针刺治疗时间等情况下,与对照组和模型组相比较,以坐骨神经损伤动物模型为观察对象,观察“深刺”、“浅刺”两种不同的进针深度是否会产生坐骨神经损伤修复效应的组间差异。如果组间差异存在,则在此基础上,完成第二个实验目标,即通过基因测序技术,分析与可能产生疗效效应的相关基因与通路,以实验数据初步回答“病有浮沉,刺有浅深”的针刺理论问题,为相关实验与临床应用提供依据。实验一材料与方法:1动物分组48只SPF级SD级大鼠(体质量300±50g)采用随机数字表法分组:空白对照组(C组),模型组(M组),浅刺环跳穴组(T1组),深刺环跳穴组(T2组),每组各12只大鼠。2神经卡压模型制备模型制备正常饲养3天后,M组、T1组、T2组于大鼠的左后肢建立神经卡压模型大鼠。于无菌实验室中,在大鼠股骨中点附近切开大鼠皮肤,钝行分离肌肉组织,暴露并游离坐骨神经。应用5mm长的医用无菌硅胶管嵌套在坐骨神经上,缝合硅胶管断端,依次缝合伤口,注射庆大霉素预防感染。14天后各组开始不同的干预方法。3各组干预措施⑴C组:为正常饲养组,无任何其他分组提到的干预措施。⑵M组:除正常饲养外,造模后的第15天开始,每天8:30开始,给予大鼠固定器固定刺激,每次15min,共14天,无其他干预措施。⑶T1组:造模后的第15天开始,每天针刺大鼠左后肢“环跳”穴。针刺要求:小动物超声影像系统进行针刺引导,直刺,仅刺入皮下肌肉组织(针尖不临近或触碰坐骨神经外膜),针刺深度为8mm左右(肌层进针约4mm作用);连接SDZ-Ⅱ型电子针疗仪,选用疏密波,设置电流1mA,频率2Hz,留针15min,共计14天。⑷T2组:造模后的第15天开始,每天8:30开始,给予固定后,针刺大鼠左后肢“环跳”穴。小动物超声影像系统引导下,直刺,针刺深度12~17mm,发现毫针临近坐骨神经外膜且引发神经周围肌肉组织抽动,则停止探索;连接SDZ-Ⅱ型电子针疗仪,选用疏密波,设置电流1mA,频率2Hz,留针每次15min,共计14天。4指标检测⑴大鼠坐骨神经功能指数检测:各组均选取12只大鼠,进行坐骨神经功能指数检测,检测时间点为正常饲养的第2天、造模后、治疗后等时间节点分别评价坐骨神经功能情况。⑵运动神经传导速度检测:治疗后每组抽取12只大鼠,应用BL-420生物机能检测仪,进行坐骨神经运动神经传导速度检测,每只鼠需要收集5次有效测量数值。⑶坐骨神经超声形态图像采集:治疗后(针刺干预第14天),每组12只大鼠。Vevo2100高分辨率小动物超声影像系统,应用高频探头MS250对各组大鼠坐骨神经进行高频超声探测。探测方法移动高频探头,沿着坐骨神经走向做多切面扫查,保存神经外膜特征图像、测量各组大鼠硅胶管近端远端神经直径,应用Contrast mode测量神经内部回声强度,在数据采集之后对以上结果进行超声描述和统计学分析。⑷透射电镜观察:治疗后,每组随机选取3只大鼠,处死后迅速暴露坐骨神经进行取材。取材方法:切取坐骨神经硅胶管远端坐骨神经一段(体积1mm~3)。固定包埋方法:材料在四氧化二锇固定液中固定,梯度脱水,浸透与包埋后,超薄切片机切割1μm厚的横截面(10000x)。以观察神经结构的轴突内容物(微管、微丝、线粒体)、雪旺细胞及其细胞核形态、髓鞘形态、神经束等部分。5统计方法应用SPSS17.0统计软件进行分析。SFI数据、MNCV数据、回声强度数据,经实验人员根据公式计算后,录入SPSS17.0软件,首先进行正态性与方差齐性检验。当满足正态性与方差齐性检验时,数据进行单因素方差分析(ANOVA);当不能满足数据正态性与方差齐性检验时,将采用非参数检验,应用Tamhane’s T2与Dunnett's法进行统计。SFI数据的前后对照研究,在经过正态性检验后,进行配对t检验。所有检验结果填入三线表格,以均数±标准差()表示(假设检验P值为0.05)。结果:1不同干预因素对各组大鼠SFI的影响⑴造模前各组大鼠SFI比较:4组大鼠饲养第2天SFI检测显示,各组大鼠SFI基本一致,组间比较差异无统计学意义(P0.05),基线相同。⑵造模后,M组、T1组、T2组SFI分别与C组比较,呈现组间差异(P0.05),表明神经卡压造模方法对大鼠造成影响,结合大鼠左下肢外观,可见术后T1组、T2组、M组大鼠均出现左后肢运动功能下降,爬行有拖拽现象,并且可见左后足足趾、足掌肿胀畸形;M组、T1组、T2组比较无组间差异(P0.05),表明神经卡压造模方法稳定,可以进行治疗干预的差异性观察。⑶治疗后SFI比较:M组、T1组、T2组分别与C组比较,呈现组间差异(P0.05),表明神经卡压造模方法在治疗后对各组大鼠造成的运动功能影响仍然存在,从外观上看,足趾肿胀与后肢行走缓慢、延迟或拖拽状态仍可见;M组、T1组比较无组间差异(P0.05),表明M组与浅刺环跳穴组在坐骨神经功能恢复方面并没有明显差异。M组、T1组与T2组比较,呈现组间差异(P0.05),可以推断深刺环跳穴对T2组的坐骨神经损伤起到更好的运动功能恢复作用,并且足趾肿胀程度下降,行走缓慢、延迟或拖拽状态得到缓解。⑷治疗前后SFI比较:可见M组、T1组治疗前后无统计学差异(P0.05);T2组治疗前后比较,有统计学差异(P0.05)。表明T2组深刺环跳穴促进坐骨神经损伤康复。2不同干预因素对各组大鼠MNCV的影响治疗后,M组、T1组、T2组分别与C组比较,MNCV呈现组间差异(P0.05),表明神经卡压造模方法对大鼠坐骨神经的神经传导速度产生影响,推断卡压模型产生一定的神经结构性损害;M组、T1组比较,无组间差异(P0.05),表明浅刺环跳穴未发生明显的对神经损伤的修复作用。M组、T1组与T2组比较,呈现组间差异(P0.05),表明深刺环跳穴对神经传导速度有恢复作用,推断周围神经结构得到更好的修复。3模型大鼠坐骨神经高频超声观察C组,神经与周围组织分界清晰,坐骨神经外膜平行高回声,光滑平坦,具有连续性。神经内部回声强;M组,大鼠卡压模型坐骨神经。坐骨神经与周围组织分界(硅胶管外)略不清晰;坐骨神经外膜具连续性;神经内部回声略低。T1组大鼠坐骨神经。坐骨神经与周围组织分界略不清;坐骨神经外膜具有连续性,神经内部回声略低。T2组大鼠坐骨神经。坐骨神经与周围组织分界略不清;坐骨神经外膜具有连续性,神经内部回声略低。各组大鼠治疗后神经回声分析可见,与C组比较,M组、T1组、T2组回声强度均下降,(P0.05);与M组比较,T1组回声强度无统计学差异(P0.05);与M组比较,T2组回声强度较强(P0.05);每组近端、远端比较无统计学差异(P0.05)。直径测量显示C组大鼠直径为0.95±0.45mm,M组模型组硅胶管近端坐骨神经直径2.28±1.10mm,远端神经直径3.70±1.01mm,远端神经水肿程度高于近端(P0.05)。T1组大鼠坐骨神经硅胶管近端坐骨神经直径2.34±0.35mm,远端神经直径3.66±0.47mm,远端神经水肿程度高于近端(P0.05)。T2组大鼠坐骨神经硅胶管近端坐骨神经直径2.32±0.75mm,远端神经直径3.62±0.64mm,远端神经水肿程度高于近端(P0.05)。但是M组与T1组、T2组比较,无统计学差异。4坐骨神经超微结构观察(电镜10000 x)C组大鼠坐骨神经外观整体上饱满,结构完整。经纤维排列整齐,髓鞘厚度一致均匀,外面可见雪旺细胞分布并包饶成为髓鞘;神经纤维内环圆滑,中央结构为轴突,形态正常可见微管或微丝。M组大鼠坐骨神经。可以见到有髓鞘神经纤维,髓鞘厚度不均匀并且出现指纹类外观,轴突萎缩空泡化,WD形成。T1组大鼠坐骨神经。图右侧可见有髓神经纤维WD,即髓鞘厚度不均匀,出现指纹类外观,轴突萎缩空泡化;图右侧(箭头指示处),可见巨噬细胞参与吞噬髓鞘与轴突碎片。T2组大鼠坐骨神经。图中央偏下方可见正在形成髓鞘的神经纤维,其外周,可见到形成髓鞘前的雪旺细胞,其特征是可见雪旺细胞基膜对新生轴突的包绕。图右上方位置以及左侧可以见到有髓神经纤维,髓鞘厚度不均匀并且出现指纹类外观,轴突萎缩,WD形成。实验二材料与方法:1动物分组SPF级SD大鼠(体质量300±50g),共12只,采用随机数字表法分组:空白对照组(C组),模型组(M),浅刺环跳穴组(S),深刺环跳穴组(T),每组各3只大鼠。2神经卡压模型制备模型制备正常饲养3天后,M组、S组、T组于大鼠的左后肢建立神经卡压模型大鼠。主要方法同实验一。3各组干预措施C组:C组为正常饲养组,无任何其他分组提到的干预措施。M组:除正常饲养外,每天8:30开始,给予大鼠固定器固定刺激,每次15min,共14天。S组:从造模第15天开始,每天8:30开始,刺大鼠环跳穴,具体操作方法同实验一T1组。T组:从造模第15天开始,每天8:30开始,针刺大鼠环跳穴,具体操作方法同实验一T2组。4坐骨神经背根神经节基因分析⑴背根神经节取材:每组3只大鼠在针刺干预后的第15天,进行取材,水合氯醛麻醉(10%,i.p.3ml/kg),在无污染条件下,迅速暴露椎管并取出L4-5节段脊髓神经节(操作时间15min),立即冻存于液氮中随即送检。⑵RNA提取方法:测序工作由北京源宜基因科技股份有限公司,应用Trizol法(天根Trizol)完成:(1)取新鲜样本100mg-200mg,迅速研磨成粉末状,加入1ml Trizol,震荡混匀;每5×106~(-7)细胞加入1mlTrizol,震荡混匀;(2)室温静置10min,使得核酸蛋白复合物完全分离。(3)加0.2ml氯仿,漩涡震荡15s,室温放置3min。(4)4℃12000rpm,离心15min,然后取上层无色水相,加等体积异丙醇,混匀,-80℃静置2h。(5)4℃12000rpm,离心15min,弃去上清。(6)加入75%乙醇1.0ml洗涤沉淀,4℃12000rpm,2min,离心。(7)用75%乙醇重复洗两次,弃上清,瞬时离心30s,用枪吸去残余液体,室温,晾干。(8)将提取的RNA进行质检后立即放置-80℃保存。⑶转录组测序实验:(1)mRNA分离和片段化;(2)FirstStrandcDNA合成;(3)SecondStrandcDNA合成;(4)1.8X体积AgencourtAMPureXP磁珠纯化双链cDNA;(5)末端修复、加A;(6)连接Adaptor;(7)片段筛选;(8)PCR库富集;(9)纯化PCR产物;(10)文库质检。⑷应用高通量测序平台Illumina HiSeq?2000测序仪对cDNA样品进行双末端(Paired-End)测序。去除原始测序结果制备文库时产生的接头序列、两端低质量序列。将过滤后的测序序列通过软件Tophat2与大鼠(Rattus norvegicus)基因组进行基因组定位分析。采用HTSeq软件对各样品定位到基因组区域或基因外显子区的测序序列(reads)的计数进行基因表达水平分析,RPKM数值0.1作为判断基因是否表达的阈值,同时定义|logFC|1,pvalue0.05,FDR0.1作为基因差异表达的阈值,并以此筛选差异表达基因(DGEs)。根据NCBI数据库的功能注释信息,使用Blast2GO软件得到差异基因的GO条目,用WEGO软件对所有的差异基因进行GO功能分类统计。然后对差异基因进行东京基因与基金组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)代谢途径分析。结果:1差异基因富集分析⑴各组大鼠有参转录组质控前后统计。本研究每个样本Q20均大于97%,Q30均大于94%,GC含量接近50%,提示较高的测序质量与测序深度,符合组间基因表达差异分析的条件。⑵基因差异表达分析。基因表达具有时间和空间特异性,研本究使用cufflinks软件的cuffdiff命令筛选差异基因。本研究实验发现:C组/M组,差异基因(DEG)数为53;C组/T组,75;M组/T组,63;C组/S组,49;M组/S组,44;T组/S组,51。⑶GO分析结果:C组/M组大鼠L4-L5背根神经节差异表达基因的GO分析结果可见:上调差异基因在多细胞组织过程,应激反应,多细胞有机过程,细胞外部分大分子复合体,催化活性结构,分子活性生物过程,等功能基因发生差异变化;下调基因在生物粘附,生物调控,细胞成分,组织或生物发生细胞过程,发育过程,生长代谢过程,多细胞过程,多细胞组织过程,细胞外基质,细胞外基质成分,细胞外区域的反应,大分子复合膜部分,结构分子活性等功能基因发生差异变化。从S组/T组大鼠L4-L5背根神经节差异表达基因的GO分析结果可见:上调差异基因为:行为,生物粘附,生物调节,细胞成分,组织或生物发生,细胞过程,发育过程,生长,免疫系统,过程,定位,运动代谢过程,多机体过程,多细胞组织过程,生殖过程,对刺激的响应,节律过程,信号,单体过程细胞,连接细胞部分,细胞外基质,细胞外区域,细胞外区域部分,大分子复合膜部分,细胞器,细胞器部分,结合催化活性趋化,活性分子传感器,活性蛋白标记结构,分子活性转运体,活性生物过程,等。下调基因主要在生物调控,细胞杀灭,细胞成分组织或生物发生,细胞过程,发育过程,免疫系统过程,对刺激信号的响应,单器官过程,细胞基质胞外区,胞外区部分,高分子复合膜部分,细胞器部分,细胞器,部分结合催化活性分子功能调节器等功能基因发生差异变化。从M组/T组大鼠L4-L5背根神经节差异表达基因的GO分析结果可见,上调差异基因在行为,生物学调控,细胞成分,组织或生物发生,细胞过程,发育过程,生长免疫系统过程,定位运动代谢过程,多机体过程,多细胞组织过程,生殖过程,对刺激信号的反应,应激反应,细胞,细胞连接,胞外区部分,胞外区部分高分子复合膜部分,细胞器部分,结合催化活性,趋化活性,核酸结合转录因子活性,蛋白标记转运体活性等功能基因发生差异变化;下调基因在生物调控,细胞杀伤,细胞成分组织或生物发生细胞过程,多细胞过程,多细胞组织过程,应激反应;单细胞过程,胞外基质,细胞外区域,胞外区域部分结合的响应等功能基因发生差异变化。⑷KEGG分析:C组/M组,KEGG分析结果(P0.05),主要信号通路为乙醛和二羧酸代谢;甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;甘油酯代谢;PPAR信号通路;白细胞经内皮迁移等。主要差异基因上调基因有PDE6A,PDE6B,PDE6G,下调基因有GLDC,gcvPA,gcvPB,gcvT,DLD,gcvH,LPL,LPL,CLDN,OCLN,ESAM,等。M组/T组,主要信号通路有:细胞粘附分子;吞噬体;轴突引导等。主要差异基因为:MHC1,MHC2,CLDN,NTN1,EFNB,ISG15,等。S组/T组,主要信号通路有:细胞粘附分子;同种异体排斥反应;移植物抗宿主病;自身免疫性甲状腺疾病;I型糖尿病;抗原处理和呈现;病毒性心肌炎;轴突引导;类受体信号通路;抗原处理和呈现等;主要差异基因为:MHC1,MHC2,CLDN,NTN1,EFNB,ISG15,DHX58,CTLA4,HLA-DR3,等。结论:1深刺组与模型组、浅刺组比较,坐骨神经功能指数(SFI)与坐骨神经运动神经传导速度(MNCV)检测数据均显示有统计学差异,说明在对照研究中,深刺组具有更好的神经功能康复趋势,并且这种作用与神经结构性修复相关。2超声检测观察到,模型组、浅刺组、深刺组大鼠坐骨神经与周围神经界限略不清晰或不清晰,其神经内部回声减低,这与神经卡压损伤有关,神经卡压损伤使神经纤维变性或减少。坐骨神经直径测量显示除对照组外,其余各组均硅胶管两端出现了神经水肿,无组间差异,提示卡压损伤使坐骨神经水肿,但不能敏锐地反应各组间坐骨神经的结构性变化。治疗后各组坐骨神经内部回声强度值采集可见,模型组、浅刺组、深刺组神经内回声强度值降低,表明三组神经不同程度的损伤;深刺组与模型组、浅刺组比较,回声强度较高,有统计学差异,回声强度值的组间变化与神经再生与修复正相关,可见深刺组更好的神经再生、修复趋势。3各组坐骨神经(受损处远端)超微结构显示:模型组、浅刺组、深刺组均出现神经损伤修复的组织特点:WD变性、巨噬细胞对髓鞘和轴突的吞噬过程等。在深刺组,还可以见到大量新生的轴突、雪旺细胞基质对轴突包绕形成髓鞘等过程,显示出更加活跃的神经再生与修复特征。可以认为,深刺环跳穴组有更好的神经修复趋势,保证了运动神经电传导的恢复和神经功能的改善。4基因重组测序技术分析发现,坐骨背根神经节各组间均存在一定数量的差异基因。其中,浅刺组与模型组、深刺组比较,可以发现浅刺的差异基因表达主要集中于乙醛和二羧酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、甘油酯代谢等,与代谢、免疫调节、细胞紧密连接等方面有关,主要的信号通路为白细胞经内皮迁移、乙醛和二羧酸代谢,光传导等信号通路等,主要影响代谢反应、免疫过程。5基因重组测序技术分析发现,深刺组与浅刺组、模型组比较,可以发现深刺组的差异基因表达主要集中于WD或抑制WD过程、轴突引导、细胞间连接、吞噬细胞发育与形成雪旺细胞迁移雪旺细胞发育等与神经损伤、凋亡、发育、再生相关的过程。相关信号通路为细胞粘附分子信号通路、轴突引导信号通路、吞噬体信号通路,这些差异基因与信号通路,可对坐骨神经损伤修复起到良性的调节与治疗作用。


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6 ;针刺对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用[N];中国医药报;2003年
7 胡世云 范武庆;单味中草药干预脏器纤维化研究进展[N];中国医药报;2003年
8 张天行;克隆大鼠意义重大[N];中国医药报;2003年
9 ;中药研究专辑(27)[N];中国中医药报;2003年
10 辛 奋;“体外培育牛黄”研发访谈录[N];中国中医药报;2004年
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