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基于Toll样受体信号介导炎症反应探讨温针灸对自发性高血压大鼠的抗炎机制

金圣博  
【摘要】:目的:本实验以自发性高血压大鼠为动物模型,在“从脾论治”高血压病的理论指导下,探寻温针灸足三里穴对自发性高血压大鼠降压机制,同时通过Toll受体信号通路(TLR4/My D88/NF-κB)介导下游炎症反应,从而探讨温针灸对自发性高血压大鼠抗炎机制及内皮细胞保护作用机制,为高血压病中医药临床防治提供可靠的基础理论依据。材料与方法:将10只雄性京都种大鼠(WKY)纳入空白组,依照随机数字表格法将40只雄性自发性高血压大鼠(SHR)随机分至模型组、温针灸组、针刺组、艾灸组,每组10只。常规饲料适应性喂养一周,采用智能无创血压计测量各组大鼠尾动脉血压,测量3次取平均值。开始实验,予正常组和模型组大鼠单纯固定20min,日一次,不予针灸干预;予温针灸组大鼠温针灸双侧足三里穴20min;予针刺组大鼠针刺双侧足三里穴20min;予艾灸组大鼠艾灸双侧足三里穴20min,日一次,连续治疗15天,同时测量实验开始后的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天上午9点~11点的各组大鼠血压,连续测量3次取平均值,录入Excel并待统计。治疗结束,予各组大鼠水合氯醛(10%)腹腔麻醉,固定、脱毛、消毒,沿腹中线开腹,暴露腹主动脉并迅速采血,将血液离心后取上清液放入无菌EP管中冻存备用,采用ELISA法检测血清炎症因子IL-6、IFN-β、TNF-α含量;血清免疫指标Ig A、Ig M、Ig G含量;血管收缩因子Ang-Ⅱ、ET-1、VEGF含量。取一段完整的腹主动脉1cm,漂洗后用4%多聚甲醛溶液固定,HE染色法进行修块、包埋、制片,荧光显微镜下观察腹主动脉壁病理形态学变化。探查腹部,迅速取脾脏组织50mg放入EP管中冻存备用,HE染色法将固定好的大鼠脾脏组织修块、包埋、制片,荧光显微镜下观察脾脏组织病理学改变及炎性细胞浸润状态;采用Western Blot法,取脾脏组织50mg,研磨、离心,吸取上清液,提取脾脏组织蛋白质,使用BCA检测法测定蛋白质浓度,通过Image J软件计算灰带条图片灰度值,定量分析出各组TLR4、My D88、NF-κB p65蛋白表达量及NF-κB p65蛋白磷酸化水平;取脾脏组织100mg,提取大鼠脾脏组织m RNA,采用q PCR法,通过逆转录反应、PCR扩增反应,导出q PCR数据并计算分析出TLR4、My D88、NF-κB p65 m RNA的表达水平。实验相关数据使用SPSS 22.0软件进行统计学分析。实验结果以均数±标准差(x±s)表示;组间数据差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),以P0.05表示具有统计学差异。结果:1.各组大鼠治疗前后血压变化:实验第2天温针灸组、针刺组血压开始逐渐下降,实验第7天血压开始显著下降,温针灸组下降幅度大于针刺组;实验第15天实验干预结束,血压降幅明显程度依次为温针灸组、针刺组、艾灸组;实验干预结束后继续测量血压至第21天发现,温针灸组与艾灸组血压较为平稳,无明显浮动,而针刺组、模型组、正常组血压均有不同程度上浮,其中针刺组血压上升幅度较为明显。2.各组大鼠脾脏动脉周围淋巴鞘及淋巴细胞分布情况:正常组与温针灸组白髓面积相对较大,动脉周围淋巴鞘组织较厚,可清晰观察到鞘内侧淋巴小结,鞘外侧分布大量且密集的淋巴细胞;而模型组、针刺组和艾灸组白髓和脾小结所占面积均有不同程度缩小,动脉周围淋巴鞘显著缩小,鞘周围淋巴细胞分布也较为稀少,其中以模型组缩小程度最为明显。3.各组大鼠血清炎症因子IL-6、IFN-β、TNF-α含量分析:与正常组比较,模型组、针刺组、艾灸组IL-6、TNF-α含量显著升高,IFN-β含量显著降低;温针灸组TNF-α含量显著升高,IFN-β含量显著降低。与模型组比较,温针灸组IL-6、TNF-α含量显著降低、IFN-β含量显著升高;针刺组TNF-α含量显著降低,艾灸组IFN-β含量显著升高。与温针灸组比较,针刺组与艾灸组IL-6、TNF-α含量显著升高,IFN-β含量显著降低。与针刺组比较,艾灸组TNF-α含量显著升高。以上差异皆具有统计学意义(P0.05)。4.血压异常与免疫炎症状态之间存在密切关联且相互影响:大鼠收缩压、舒张压与IL-6、TNF-α含量之间呈正相关,与IFN-β含量之间呈负相关,说明随着大鼠血压值的升高,血清内IL-6、TNF-α含量也随之增加,加快血清炎症因子的表达,而IFN-β含量随之降低。5.Toll样受体信号通路(TLR4/My D88/NF-κB)中的各信号分子蛋白表达及NF-κB p65磷酸化水平:与正常组比较,模型组、针刺组TLR4、My D88、NF-κB p65蛋白表达及NF-κB p65蛋白磷酸化水平显著升高,温针灸组只有TLR4蛋白表达和NF-κB p65蛋白磷酸化水平显著升高,而艾灸组TLR4、NF-κB p65蛋白表达及NF-κB p65蛋白磷酸化水平显著升高;与模型组相比,温针灸组TLR4、My D88、NF-κB p65蛋白表达及NF-κB p65蛋白磷酸化水平显著降低;与温针灸组比较,针刺组TLR4、My D88、NF-κB p65蛋白表达及NF-κB p65蛋白磷酸化水平显著升高,而艾灸组TLR4、NF-κB p65蛋白表达及NF-κB p65蛋白磷酸化水平显著升高。以上差异皆具有统计学意义(P0.05)。6.Toll样受体信号通路(TLR4/My D88/NF-κB)中的各信号分子基因表达情况:与正常组比较,模型组、针刺组、艾灸组大鼠脾脏组织TLR4、My D88、NF-κB p65 m RNA表达水平显著升高,温针灸组TLR4、My D88表达水平显著升高;与模型组比较,温针灸组大鼠脾脏组织TLR4、My D88、NF-κB p65 m RNA表达水平显著降低,针刺组TLR4表达水平有所降低,而艾灸组TLR4、My D88 m RNA表达水平下降;与温针灸组比较,针刺组和艾灸组大鼠脾脏组织TLR4、My D88、NF-κB p65 m RNA表达水平显著升高。以上差异皆具有统计学意义(P0.05)。7.各组腹主动脉壁HE染色结果分析:正常组主动脉壁内膜光滑完整,各层细胞排列有序,内皮细胞未见脱落、增生,中膜平滑肌细胞及弹性纤维紧密排列有序;模型组腹主动脉壁内膜明显增生、增厚、凸起,内皮细胞存在脱落情况,中膜平滑肌层排列混乱,有增生、肥大,部分区域出现变形、萎缩,弹性纤维间隔参差不齐,偶有断裂、皱褶现象,外膜细胞欠平整,偶有脱落情况;温针灸组腹主动脉壁内膜略粗糙,少许内皮细胞脱落,中膜平滑肌细胞排列偶有弯曲、褶皱,弹性纤维间隙大致均匀,部分出现缩小现象;针刺组大鼠腹主动脉壁内膜粗糙、欠平整,内皮细胞存在脱落现象,中膜平滑肌细胞增生、肥大、排列紊乱,弹性纤维出现褶皱、变形,间隙欠均匀,部分外膜出现突起、变形及细胞脱落现象;艾灸组大鼠腹主动脉壁内膜褶皱、变形,内皮细胞有脱落现象,中膜平滑肌细胞部分萎缩、减少,排列欠整齐,弹性纤维间隙不均匀,外膜欠光滑,偶有增生现象。8.各组血清免疫学指标比较:与正常组比较,模型组和艾灸组血清Ig A、Ig G含量显著降低,血清Ig M含量显著升高,而针刺组血清Ig A含量显著降低;与模型组比较,温针灸组血清Ig A、Ig G含量显著升高,艾灸组血清Ig G含量显著降低;与温针灸组比较,针刺组血清Ig A含量显著降低,艾灸组血清Ig A、Ig G含量显著降低;与针刺组比较,艾灸组血清Ig G含量显著降低。以上差异皆具有统计学意义(P0.05)。9.各组血清AngⅡ、ET-1、VEGF含量比较:与正常组比较,模型组、艾灸组血清AngⅡ、ET-1、VEGF含量显著升高,温针灸组血清ET-1含量显著升高,针刺组血清AngⅡ、ET-1含量显著升高;与模型组比较,温针灸组AngⅡ、ET-1、VEGF含量显著降低,针刺组ET-1、VEGF含量显著降低,艾灸组ET-1含量显著降低;与温针灸组比较,针刺组ET-1含量显著增高,艾灸组AngⅡ、ET-1、VEGF含量显著增高,以上差异均有统计学意义(P0.05)。结论:1温针灸足三里可显著降低自发性高血压大鼠血压,疗效平稳、持久。2血压异常与免疫炎症状态之间存在密切关联且相互影响;温针灸足三里穴可显著改善自发性高血压大鼠体内存在的炎症状态。3温针灸足三里穴可通过抑制大鼠脾组织Toll样受体信号通路中TLR4、My D88、NF-κB p65蛋白及m RNA表达调控信号传导。4温针灸足三里穴可通过调控TLR4/My D88/NF-κB信号通路,减轻血清炎症状态,提高血清抗炎能力,良性调控血管舒缩功能,从而降低炎性损伤程度,发挥对内皮细胞的保护作用。


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