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“肾脑相济”电针疗法激活PDD模型大鼠BMSCs-Exo脑靶向作用的机制研究

周歆  
【摘要】:目的:围绝经期抑郁症(Perimenopausal Depressive Disorder,PDD)是中老年女性最常见的情感性精神障碍疾病之一,脑内海马区神经元细胞失活是伴随围绝经期抑郁症发生的重要病理基础。本研究基于“肾-天癸-脑”理论,通过开展SD大鼠体内外实验,观察骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem cells,BMSCs)来源外泌体(-Exo)对海马区神经元的靶向性修复作用,探索SDF-1/CXCR4轴与BMSCs-Exo脑靶向作用的内在相关性,旨在从细胞分子水平阐释“肾脑相济”电针疗法治疗PDD作用机制,为中医“肾-天癸-脑”体系理论寻求现代科学证据支持。材料与方法:1.采用全骨髓贴壁法分离、纯化、培养SD大鼠来源BMSCs细胞,采用显微镜观察细胞形态,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原;运用超高速离心法提取、纯化BMSCs-Exo,通过透射电子显微镜(TEM)鉴定外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析(NTA)确定外泌体颗粒大小,Western blot鉴定BMSCs-Exo表面抗原,采用分子排阻(SCS)法分离并富集BMSCs-Exo。2.将30只雌性SD大鼠随机分为五组:空白组、模型组、百会组、电针组、西药组,每组6只。除空白组外,模型组、百会组、电针组、西药组大鼠均采用卵巢摘除术联合慢性不可预见性温和刺激复制PDD大鼠模型,分别给予“百会”穴针刺、“肾脑相济”电针疗法以及盐酸氟西汀(百忧解)灌胃,连续干预2周;应用代谢笼及糖水偏嗜实验(SCT)、强迫游泳实验(FST)观察各组大鼠抑郁状态下行为学及运动模式变化,小动物活体成像(IVIS)法检测BMSCs-Exo在大鼠脑部汇聚情况,HE染色法观察各组大鼠海马神经元细胞形态改变,Elisa法检测各组大鼠血清及脑部各区域间SDF-1的表达,Western blot检测骨髓中CXCR4的表达。3.体外培养SD大鼠脑海马区神经元细胞,运用CCK8法测定不同浓度CORT对神经元细胞形态及活力的影响;采用20μmol/L浓度的CXCR4拮抗剂抑制SDF-1/CXCR4轴的趋化作用,采用CORT干预神经元细胞,模拟抑郁状态下海马神经元细胞损伤;观察CXCR4被抑制后的BMSCs-Exo与神经元细胞结合能力的改变及脑靶向功能的变化。结果:1.成功分离并培育了大鼠BMSCs,通过显微镜形态观察、表面抗原检测等鉴定手段,确认细胞培育结果符合BMSCs特征;收集BMSCs培养上清液,采用超高速离心法分离并提取了BMSCs-Exo,通过TEM、NTA及WB表面抗原鉴定,确认提取产物符合外泌体特征;采用SCS法成功分离并富集BMSCs-Exo。2.成功复制PDD大鼠模型;检测结果显示,电针组及西药组大鼠与模型组相比摄食量、饮水量增加(P0.05),电针组呼吸交换速率(RER)上升(P0.05);其余各组与模型组差异无统计学意义(P0.05)。SCT实验结果结果显示,电针组及西药组蔗糖溶液消耗率均较模型组有显著提升(P0.0001)。FCT实验结果结果显示,电针组及西药组不动时间均较模型组有显著降低(电针组P0.001,西药组P0.01);各组大鼠游泳时间无显著差异变化;百会组、电针组及西药组攀爬时间均较模型组升高(百会组P0.001,电针组、西药组P0.0001)。提示“肾脑相济”电针疗法及氟西汀灌胃均能有效改善PDD模型大鼠抑郁状态。3.IVIS活体成像结果显示,DiR标记的BMSCs-Exo经尾静脉注射后,大鼠体内荧光信号逐渐增强,直到12h时荧光强度达到峰值,24h时荧光减弱直至消失;与其他时间点相比,12h时大鼠脑部部的荧光信号最强;平均荧光强度分析结果显示,经尾静脉注射BMSCs-Exo 12h后,模型组大鼠脑区内平均荧光强度显著低于空白组大鼠(P0.001);百会组、电针组大鼠脑区内平均荧光强度高于模型组大鼠(百会组P0.01,电针组P0.001);西药组大鼠脑区内平均荧光强度较模型组升高(P0.05),但仍低于百会组及电针组大鼠脑区内平均荧光强度(百会组P0.05,电针组P0.001)。提示“肾脑相济”电针疗法中针刺“百会”穴能够增强BMSCs-Exo对脑部的趋化作用。4.Elisa检测结果显示,与空白组相比,模型组大鼠脑内海马区SDF-1含量降低(P0.05),电针组海马区SDF-1高于模型组(P0.05),其余各组与模型组差异无统计学意义。Western blot结果结果显示,各组间骨髓细胞CXCR4含量变化无显著性差异。提示SDF-1可能是介导BMSCs-Exo在头部靶向性汇聚的重要影响因素,与中医“肾-天癸-脑”体系理论有密切联系。5.成功在体外培养海马神经元细胞,CCK8结果显示,25μmol/L浓度CORT处理对神经元细胞活性产生较强影响,与抑郁状态下模型大鼠神经元形态及活性相类似,能够在体外模拟抑郁状态下脑神经元内环境。6.神经元荧光染色结果显示,AMD3100干预后BMSCs-Exo对神经元细胞结合能力显著降低,IVIS活体成像结果显示,AMD3100干预后BMSCs-Exo对BMSCs-Exo的脑靶向能力显著低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。提示调节SDF-1/CXCR4轴是影响BMSCs-Exo对脑内神经元趋化作用的关键因素。结论:1.将中医“天癸”理论加入“肾脑相济”体系的构建,提出“肾-天癸-脑”理论,对传统中医“天癸”理论做出了新的拓展,为“肾脑相济”电针疗法治疗PDD提供了新的理论证据支持。2.“肾脑相济”电针疗法能够有效缓解PDD大鼠抑郁症状,增强BMSCs-Exo在头部的汇聚现象,针刺百会穴可能是通过增强SDF-1/CXCR4的趋化效应,实现对受损的海马神经元的靶向汇聚作用。3.SDF-1/CXCR4是影响BMSCs-Exo对脑内神经元靶向性汇聚的重要影响因素,该趋化作用可能是“肾脑相济”电针疗法治疗PDD的重要起效途径,为中医“肾-天癸-脑”体系理论提供了现代医学证据支持。


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