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基于Th1/Th2平衡研究沙棘果油及其有效成分对特应性皮炎小鼠的干预作用

王欣欣  
【摘要】:目的:观察沙棘果油及沙棘总黄酮(total flavonoids of Hippophae rhamnoides L.,TFH)对特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)小鼠的干预作用及免疫学机制,为从天然产物中寻找AD的治疗方法提供依据。材料与方法:第一部分:健康雌性SPF级BALB/c小鼠,采用随机数字表法分为4组:正常对照组、AD模型组、低剂量沙棘果油干预组和高剂量沙棘果油干预组,每组6只。实验第1天,给所有小鼠背部皮肤做除毛处理,除毛面积约2×2 cm2。于实验第1、4、7天,使用浓度为1%的DNCB溶液200μL对AD模型组、低剂量沙棘果油干预组和高剂量沙棘果油干预组小鼠背部皮肤进行致敏,每天一次,共致敏3次。于实验第14、17、19、22、24、27、29天,使用浓度为0.5%的DNCB溶液20μL涂抹于AD模型组、低剂量沙棘果油干预组和高剂量沙棘果油干预组小鼠左耳背部皮肤处进行激发,在上述时间点每天激发一次。正常对照组小鼠于相同时间点涂抹等体积的DNCB基质溶液。自实验第15天起,分别对低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠按照不同浓度灌胃沙棘果油,低剂量沙棘果油干预组按照5ml/kg浓度灌胃,高剂量沙棘果油干预组按照10ml/kg浓度灌胃,BALB/c小鼠体质量20±2g,最终的给药剂量为高剂量沙棘果油干预组小鼠灌胃沙棘果油0.2ml,低剂量沙棘果油干预组小鼠灌胃沙棘果油0.1ml,橄榄油0.1ml,正常对照组和AD模型组小鼠均灌胃橄榄油0.2ml。每天灌胃一次,至实验第29天结束。从实验第15天开始,每天观察各组小鼠左耳皮损严重程度,每间隔3天应用数字厚度测量仪测量所有小鼠左耳相同部位皮肤厚度并记录数值。实验第30天,眼眶取血后颈椎脱臼法处死小鼠,分离左耳组织及颌下淋巴结,称量淋巴结重量并记录,左耳置于4%多聚甲醛固定,淋巴结一部分制成单细胞悬液用于流式检测,另一部分-80oC冻存。采用苏木素伊红(HE)染色观察各组小鼠左耳皮肤组织病理形态表现;采用甲苯胺蓝(TB)染色观察各组小鼠左耳皮肤组织中肥大细胞数;采用ELISA方法检测各组小鼠血清中Ig E水平;采用免疫组织化学技术检测各组小鼠左耳部组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP蛋白表达水平;采用荧光定量PCR法检测各组小鼠颌下淋巴结组织中IL-4、IFN-γ和TNF-αm RNA表达水平;采用流式细胞术检测各组小鼠颌下淋巴结单细胞悬液中CD207/CD326、CD86、OX40和MHCⅡ阳性表达细胞所占百分比。第二部分:健康雌性SPF级C57BL/6小鼠,采用随机数字表法分为4组:正常对照组、AD模型组、基质组和TFH干预组,每组6只。从实验第1天起,AD模型组、基质组和TFH干预组小鼠均涂抹2 nmo L MC903(20μL,溶剂为无水乙醇),每日下午于小鼠左耳背部皮肤涂抹一次,共涂抹14天。正常对照组小鼠于相同时间点相同部位涂抹20μL无水乙醇,亦共涂抹14天。自实验第7天起,基质组、TFH干预组小鼠分别涂抹TFH基质和1%TFH乳剂(各20μg),每日清晨于小鼠左耳背部皮肤涂抹一次,共涂抹8天。对照组和AD模型组小鼠不做处理。从实验第7天起,每天观察各组小鼠左耳皮损严重程度,于实验第7、10、12、15天,每天应用数字厚度测量仪测量所有小鼠左耳相同部位的皮肤厚度并记录数值。实验第15天,眼眶取血后颈椎脱臼法处死小鼠,分离左耳组织及颌下淋巴结。左耳一部分置于4%多聚甲醛固定,另一部分置于-80oC冻存。淋巴结置于4%多聚甲醛固定。采用HE染色观察各组小鼠左耳皮肤组织病理形态表现;采用TB染色计数各组小鼠左耳皮肤组织中肥大细胞数;采用免疫组织化学技术检测各组小鼠左耳皮肤组织中FLG和LOR表达水平;采用荧光定量PCR法检测各组小鼠左耳皮肤组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP m RNA表达水平。人永生化角质形成细胞株(Ha Ca T细胞),以含10%FBS,双抗(青霉素,100U/m L;链霉素,100μg/m L)的高糖DMEM培养液培养,培养条件:温度37℃,CO2浓度5%,隔日1:2传代。细胞培养至所需瓶数,根据研究目的将细胞进行分组。共分为四个检测部分进行相关指标检测。(1)不同浓度TFH对Ha Ca T细胞增殖活性的影响,采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性;(2)TFH对Ha Ca T细胞分泌细胞因子的筛查,采用细胞因子芯片技术,对各组细胞分泌的细胞因子进行筛查;(3)采用ELISA验证细胞因子芯片结果;(4)TFH对TNF-α/IFN-γ刺激Ha Ca T细胞MAPK-NF-κB信号通路的影响,采用Western-blot法检测各组细胞中p38、p-p38、ERK、p-ERK、NF-κB、p-NF-κB表达水平。结果:第一部分1肉眼观察显示:正常对照组小鼠左耳部皮肤在整个实验过程中均未见明显炎症损害表现。AD模型组小鼠左耳部皮肤于实验第7天开始出现红肿、粗糙、变硬,第14天开始出现表皮干燥和脱屑,随着激发次数增多,皮肤炎症症状逐渐加重,部分小鼠出现皮肤溃烂及出血。低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠皮肤炎症症状随着干预时间的延长逐渐改善。与正常对照组比较,AD模型组小鼠皮肤炎症评分显著升高,差异有统计学意义(p0.01),与AD模型组相比,低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠皮肤炎症评分显著降低,差异有统计学意义(p0.01)。2 HE染色结果显示:正常对照组小鼠左耳部皮肤结构规则,细胞形态正常,上皮层次清晰完整。AD模型组小鼠左耳部皮损处皮肤表皮角化过度伴随有部分区域角化不全,与正常对照组比较,AD模型组小鼠左耳上皮层厚度显著增加,差异有统计学意义(p0.01)。低剂量和高剂量沙棘果油干预组表皮仍可见轻度角化过度现象。与AD模型组比较,低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠左耳上皮层厚度显著变薄,差异有统计学意义(p0.01)。3 TB染色结果显示:与正常对照组比较,AD模型组、低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠左耳部皮肤组织中肥大细胞数均显著增多,差异有统计学意义(p0.01),与AD模型组比较,低剂量和高剂量沙棘果油干预组肥大细胞数均显著减少,差异有统计学意义(p0.01)。4各组小鼠血清Ig E水平检测显示:与正常对照组比较,AD模型组、低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠血清Ig E水平均增高,差异有统计学意义(p0.01或p0.05)。与AD模型组比较,低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠血清Ig E水平显著降低,差异有统计学意义(p0.01)。5各组小鼠颌下淋巴结质量显示:与正常对照组比较,AD模型组、低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠颌下淋巴结质量均增高,差异有统计学意义(p0.01或p0.05),与AD模型组比较,低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠颌下淋巴结质量均出现下降,差异有统计学意义(p0.01或p0.05)。6各组小鼠左耳组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP免疫组织化学染色结果平均光密度(AOD)检测显示:与正常对照组比较,AD模型组、低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠左耳组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(p0.01)。与AD模型组比较,低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠左耳组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(p0.01)。7各组小鼠颌下淋巴结中IL-4、IFN-γ和TNF-α的m RNA表达水平检测显示:与正常对照组比较,AD模型组、低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠的IL-4、IFN-γ和TNF-α的m RNA表达水平都出现升高,差异有统计学意义(p0.01或p0.05)。与AD模型组比较,高剂量沙棘果油干预组小鼠的IL-4、IFN-γ和TNF-α的m RNA表达水平呈现出下降,差异有统计学意义(p0.01或p0.05)。与AD模型组比较,低剂量沙棘果油干预组小鼠的IFN-γ和TNF-α的m RNA表达水平明显下降,差异有统计学意义(p0.05)。8各组小鼠颌下淋巴结单细胞悬液中CD207/CD326、CD86、OX40和MHCⅡ阳性表达的细胞百分比检测结果显示:与正常对照组比较,AD模型组小鼠颌下淋巴结单细胞悬液中CD207/CD326、CD86、OX40和MHCⅡ阳性细胞所占的比例均显著升高,差异有统计学意义(p0.01)。与AD模型组比较,沙棘果油干预组小鼠颌下淋巴结单细胞悬液中CD207/CD326、CD86、OX40和MHCⅡ阳性细胞所占的比例均显著下降,差异有统计学意义(p0.01)。并且,各组阳性细胞下降的趋势与沙棘果油剂量呈相关性。第二部分1肉眼观察显示:正常对照组小鼠左耳部皮肤在整个实验过程中均未见明显炎症损害改变表现。AD模型组小鼠左耳部皮肤于实验第7天开始出现红肿、粗糙、变硬,随着涂抹MC903次数的增加,小鼠逐渐出现表皮干燥和脱屑,皮肤炎症症状日渐加重,个别小鼠左耳部皮肤出现溃烂和出血。基质组和AD模型组小鼠左耳部皮损表现无明显差别。TFH干预组小鼠皮肤炎症症状随着干预时间的延长逐渐改善,溃烂和出血表现减轻至消失。与正常对照组比较,AD模型组、基质组及TFH干预组小鼠左耳部皮肤炎症评分均显著增加,差异有统计学意义(p0.01);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠左耳部皮肤炎症评分显著降低,差异有统计学意义(p0.01),基质组小鼠左耳部皮肤炎症评分无统计学差异(p0.05)2各组小鼠左耳厚度测量结果显示:实验第7天,与正常对照组比较,AD模型组、基质组和TFH干预组小鼠左耳厚度显著增加,差异有统计学意义(p0.01)。实验第10天,与正常对照组比较,AD模型组、基质组和TFH干预组小鼠左耳厚度均显著增加,差异有统计学意义(p0.01);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠左耳厚度明显减小,差异有统计学意义(p0.05)。实验第12天和第15天,与正常对照组比较,AD模型组、基质组和TFH干预组小鼠左耳厚度均显著增加,差异有统计学意义(p0.01);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠耳厚度显著减小,差异有统计学意义(p0.01)。实验第7、10、12、15天,与AD模型组比较,基质组小鼠左耳厚度均无统计学差异(p0.05)。3 HE染色结果显示:正常对照组小鼠左耳部皮肤结构规则,细胞形态正常,上皮层次清晰完整。AD模型组小鼠左耳部皮损处皮肤表皮角化过度伴随有部分区域角化不全,与正常对照组比较,AD模型组小鼠左耳部皮损处上皮层厚度明显增加,差异有统计学意义(p0.01)。与AD模型组相比,TFH干预组小鼠左耳部皮损处上皮层厚度显著变薄,差异有统计学意义(p0.01),基质组小鼠上皮层厚度无统计学差异(p0.05)。4 TB染色结果显示:与正常对照组比较,AD模型组、基质组和TFH干预组小鼠左耳部皮肤组织中肥大细胞数均显著增多,差异有统计学意义(p0.01),与AD模型组相比,TFH干预组小鼠左耳部皮肤组织中肥大细胞数显著减少,差异有统计学意义(p0.01),基质组小鼠左耳部皮肤组织中肥大细胞数无统计学差异(p0.05)。5各组小鼠颌下淋巴结质量统计结果显示:与正常对照组比较,AD模型组、基质组、TFH干预组小鼠颌下淋巴结质量显著增大,差异有统计学意义(p0.01);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠颌下淋巴结质量显著减小,差异有统计学意义(p0.01),基质组小鼠颌下淋巴结质量无统计学差异(p0.05)。6各组小鼠左耳部皮损处皮肤组织中FLG、LOR表达水平检测显示:与正常对照组比较,AD模型组、基质组小鼠左耳部皮损处皮肤组织中FLG、LOR表达水平显著下调,差异有统计学意义(p0.01),TFH干预组小鼠左耳部皮损处皮肤组织中FLG、LOR表达水平无统计学差异(P0.05);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠左耳部组织中FLG、LOR表达水平显著上调,差异有统计学意义(p0.01);AD模型组和基质组比较,FLG、LOR的表达水平无统计学差异(p0.05)。7各组小鼠左耳部组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP m RNA表达水平检测显示:与正常对照组比较,AD模型组、基质组、TFH干预组小鼠左耳部组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP m RNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(p0.01);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠左耳部组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和及TSLP m RNA表达水平下调,差异有统计学意义(p0.01或P0.05),基质组IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP m RNA表达水平无统计学差异(p0.05)。8不同浓度的TFH对Ha Ca T细胞增殖活性影响检测显示:与0mg·L-1 TFH组比较,仅2.5 mg·L-1 TFH组OD值呈现明显升高,差异有统计学意义(p0.05)。9细胞因子抗体阵列检测显示:与空白对照组比较,TNF-α/IFN-γ组细胞培养上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-3、MDC、PDGF-BB和TARC含量明显升高,差异有统计学意义(p0.05);与TNF-α/IFN-γ组比较,TNF-α+IFN-γ+TFH组细胞培养上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-3、MDC、PDGF-BB和TARC含量明显降低,差异有统计学意义(p0.05)。10 ELISA法检测各组细胞培养上清液中IL-6、MDC和TARC含量显示:与空白对照组比较,其余四组细胞培养上清液中IL-6、MDC、TARC的含量均显著升高,差异有统计学意义(p0.01);与TNF-α/IFN-γ模型组比较,不同浓度TFH干预组细胞培养上清液中IL-6、MDC、TARC的含量均显著降低,差异有统计学意义(p0.01);三个浓度的TFH干预组细胞培养上清液中IL-6、MDC、TARC的含量随TFH浓度增加而降低,呈量效关系。11 Western-blot法检测各组细胞p38、ERK、NF-κB蛋白及其磷酸化蛋白表达水平显示:各组细胞中p38、ERK和NF-κB蛋白表达水平无统计学差异(p0.05);与空白对照组比较,TNF-α/IFN-γ模型组中p-P38、p-ERK和p-NF-κB表达水平显著上调,差异有统计学意义(p0.01);与TNF-α/IFN-γ模型组比较,三个浓度TFH干预组细胞中p-p38、p-ERK和p-NF-κB表达水平显著下调,差异有统计学意义(p0.01),且呈量效关系。结论:1沙棘果油能够减轻AD小鼠皮肤局部炎症反应,降低AD小鼠由Ig E介导的超敏反应强度,抑制AD小鼠局部引流淋巴结的免疫应答强度。2沙棘果油通过抑制AD小鼠皮损部位皮肤组织中TSLP表达,进而抑制皮肤LCs的迁移和成熟,调节Th1/Th2平衡。3 TFH能够减轻AD小鼠皮肤局部炎症反应,抑制AD小鼠局部引流淋巴结的免疫应答强度。4 TFH上调AD小鼠皮损组织中FLG、LOR的表达水平,修复AD小鼠皮肤屏障。5 TFH通过抑制AD小鼠皮损部位皮肤组织中TSLP的表达,改善AD小鼠Th1/Th2失衡状态。6浓度为2.5 mg·L-1的TFH对Ha Ca T细胞具有促增殖作用。7 TFH通过MAPK-NF-κB信号通路抑制TNF-α/IFN-γ诱导的Ha Ca T炎症反应。


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13 许燕;Hlx对Th1/Th2平衡的调节及其与脑/脊髓损伤关系的研究[D];江苏大学;2014年
14 熊亮;川芎嗪对哮喘大鼠Th1/Th2细胞因子的影响及机制研究[D];华中科技大学;2008年
15 郭威;慢性重型乙型肝炎患者HBV BCP/前C区基因变异及Th1/Th2免疫状态的研究[D];华中科技大学;2006年
16 陈吉;肠易激综合征患者肠粘膜脑肠肽与肥大细胞变化及其Th1/Th2漂移的研究[D];中南大学;2012年
17 石昭泉;Th1/Th2细胞因子在哮喘气道粘液细胞化生和凋亡中的作用[D];第二军医大学;2003年
18 裴文娅;基于Th1/Th2、MMPs/TIMPs探讨火针四花穴对非小细胞肺癌化疗患者的影响[D];广州中医药大学;2016年
19 蒋毅;吸烟对哮喘Th1/Th2平衡的影响及转录调节机制研究[D];山西医科大学;2009年
20 李奇凤;Notch信号通路调控Th1/Th2平衡在结核菌感染中的作用研究[D];新疆医科大学;2017年
中国硕士学位论文全文数据库 前20条
1 许朝进;从Th1/Th2漂移探讨千佛菌对Ⅰ型糖尿病小鼠的防治作用和免疫学机理[D];陕西中医学院;2006年
2 顾珺;玉屏风散对小鼠气道变态反应性疾病Th1/Th2平衡的影响[D];第二军医大学;2005年
3 马素豪;辽藁本对动脉粥样硬化家兔的疗效及Th1/Th2免疫平衡轴的作用机制探究[D];辽宁中医药大学;2019年
4 董丹;复发性流产患者外周血中Th1和Th2细胞水平及Th1/Th2平衡状态研究[D];河北医科大学;2019年
5 李子菡;过敏性紫癜分型与外周血Th1/Th2迁移的相关性及复方甘草酸苷对Th1、Th2的影响及其疗效观察[D];承德医学院;2018年
6 张静静;加味升降散对过敏性紫癜性肾炎小鼠Th1/Th2迁移的影响[D];山东中医药大学;2016年
7 武雷;苦马豆素对孕小鼠Th1/Th2平衡及相关细胞因子调控作用的研究[D];四川农业大学;2015年
8 时瑛;乳腺癌患者外周血Th1/Th2与雌激素水平相关性研究[D];新疆医科大学;2012年
9 张志大;口服卡介苗对哮喘患者Th1/Th2平衡的影响[D];南昌大学;2007年
10 刘红艳;三物白散逆转荷瘤机体Th1/Th2漂移及其作用机制研究[D];南京中医药大学;2005年
11 张交生;甘草甜素对过敏性紫癜Th1/Th2失衡的调节[D];吉林大学;2007年
12 彭广华;从Th1/Th2漂移探讨千佛菌对环磷酰胺模型小鼠的免疫调节作用[D];陕西中医学院;2007年
13 陈海林;子宫内膜癌患者手术前后外周血Th1/Th2细胞因子表达的研究[D];广西医科大学;2013年
14 宋秋红;白花蛇舌草对哮喘模型小鼠Th1/Th2类细胞因子的影响[D];延边大学;2012年
15 石伟;特发性血小板减少性紫癜患者Th1/Th2的细胞因子水平及临床意义[D];新疆医科大学;2012年
16 王清睿;益气养阴法逆转老年非小细胞肺癌患者Th1/Th2漂移状态的分子机制研究[D];华中科技大学;2010年
17 谢维丽;肝郁脾虚型HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者Th1/Th2类细胞功能研究[D];福建中医药大学;2011年
18 张浩;乳铁蛋白对Th1/Th2细胞平衡的影响研究[D];天津商业大学;2012年
19 茅君卿;化疗后粒细胞缺乏患儿感染时Th1/Th2细胞因子动态检测的临床意义[D];浙江大学;2009年
20 余江清;口服卡介苗对哮喘小鼠气道炎症细胞及外周血Th1/Th2平衡的影响[D];南昌大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前20条
1 本报记者 崔丽;刘志峰:荒漠生长沙棘梦[N];中国青年报;2011年
2 张晨;用沙棘串起金色产业链[N];兵团日报(汉);2019年
3 本报记者 姜慧仁 杨曼艺;沙棘果:山村人的“致富果”[N];平凉日报;2020年
4 本报记者 谢慧变;小沙棘做成大产业[N];新疆日报(汉);2019年
5 本报记者 谭琦 潘蕾;小小沙棘果 铺就致富路[N];佳木斯日报;2018年
6 王闯 记者 吴双;桦南立足优势种植沙棘热情高[N];佳木斯日报;2017年
7 实习记者 朱治宇 通讯员 孙晓慧;小沙棘果做成大文章[N];呼和浩特日报(汉);2008年
8 ;新疆野生沙棘果 世界之珍品[N];兵团日报(汉);2000年
9 张青丽;我国研究出沙棘果废渣利用技术[N];中国绿色时报;2004年
10 张学全;沙棘果废渣利用技术通过鉴定[N];中国乡镇企业报;2004年
11 ;泰来:沙棘果坠满枝头[N];黑龙江日报;2005年
12 李艳红;沙棘果成了青河百姓致富“金豆豆”[N];新疆科技报(汉);2015年
13 王洪波 记者 司汉科;荣军:沙棘果满枝头亩收近千[N];黑龙江日报;2004年
14 记者 贺占强 通讯员 樊义成;沙棘果蛋蛋成为增收的钱串串[N];延安日报;2006年
15 记者 李涛;小小沙棘果将成就大产业[N];齐齐哈尔日报;2010年
16 本报记者 田丽;宇航人:小小沙棘果做成大产业[N];经理日报;2007年
17 见习记者 贾莹莹;小小沙棘果变身致富“摇钱树”[N];中国妇女报;2015年
18 本报克州记者站 沙热古丽;不毛之地结出致富沙棘果[N];新疆日报(汉);2020年
19 驻站记者 姚井东 通讯员 左志然;根植沃土枝更繁[N];赤峰日报;2014年
20 特约记者 郝劲飞 记者 冯涛;小小沙棘果托起泰来“沙产业”[N];齐齐哈尔日报;2007年
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