基于Th1/Th2平衡研究沙棘果油及其有效成分对特应性皮炎小鼠的干预作用

【摘要】：目的:观察沙棘果油及沙棘总黄酮(total flavonoids of Hippophae rhamnoides L.,TFH)对特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)小鼠的干预作用及免疫学机制,为从天然产物中寻找AD的治疗方法提供依据。材料与方法:第一部分:健康雌性SPF级BALB/c小鼠,采用随机数字表法分为4组:正常对照组、AD模型组、低剂量沙棘果油干预组和高剂量沙棘果油干预组,每组6只。实验第1天,给所有小鼠背部皮肤做除毛处理,除毛面积约2×2 cm2。于实验第1、4、7天,使用浓度为1%的DNCB溶液200μL对AD模型组、低剂量沙棘果油干预组和高剂量沙棘果油干预组小鼠背部皮肤进行致敏,每天一次,共致敏3次。于实验第14、17、19、22、24、27、29天,使用浓度为0.5%的DNCB溶液20μL涂抹于AD模型组、低剂量沙棘果油干预组和高剂量沙棘果油干预组小鼠左耳背部皮肤处进行激发,在上述时间点每天激发一次。正常对照组小鼠于相同时间点涂抹等体积的DNCB基质溶液。自实验第15天起,分别对低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠按照不同浓度灌胃沙棘果油,低剂量沙棘果油干预组按照5ml/kg浓度灌胃,高剂量沙棘果油干预组按照10ml/kg浓度灌胃,BALB/c小鼠体质量20±2g,最终的给药剂量为高剂量沙棘果油干预组小鼠灌胃沙棘果油0.2ml,低剂量沙棘果油干预组小鼠灌胃沙棘果油0.1ml,橄榄油0.1ml,正常对照组和AD模型组小鼠均灌胃橄榄油0.2ml。每天灌胃一次,至实验第29天结束。从实验第15天开始,每天观察各组小鼠左耳皮损严重程度,每间隔3天应用数字厚度测量仪测量所有小鼠左耳相同部位皮肤厚度并记录数值。实验第30天,眼眶取血后颈椎脱臼法处死小鼠,分离左耳组织及颌下淋巴结,称量淋巴结重量并记录,左耳置于4%多聚甲醛固定,淋巴结一部分制成单细胞悬液用于流式检测,另一部分-80oC冻存。采用苏木素伊红(HE)染色观察各组小鼠左耳皮肤组织病理形态表现;采用甲苯胺蓝(TB)染色观察各组小鼠左耳皮肤组织中肥大细胞数;采用ELISA方法检测各组小鼠血清中Ig E水平;采用免疫组织化学技术检测各组小鼠左耳部组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP蛋白表达水平;采用荧光定量PCR法检测各组小鼠颌下淋巴结组织中IL-4、IFN-γ和TNF-αm RNA表达水平;采用流式细胞术检测各组小鼠颌下淋巴结单细胞悬液中CD207/CD326、CD86、OX40和MHCⅡ阳性表达细胞所占百分比。第二部分:健康雌性SPF级C57BL/6小鼠,采用随机数字表法分为4组:正常对照组、AD模型组、基质组和TFH干预组,每组6只。从实验第1天起,AD模型组、基质组和TFH干预组小鼠均涂抹2 nmo L MC903(20μL,溶剂为无水乙醇),每日下午于小鼠左耳背部皮肤涂抹一次,共涂抹14天。正常对照组小鼠于相同时间点相同部位涂抹20μL无水乙醇,亦共涂抹14天。自实验第7天起,基质组、TFH干预组小鼠分别涂抹TFH基质和1%TFH乳剂(各20μg),每日清晨于小鼠左耳背部皮肤涂抹一次,共涂抹8天。对照组和AD模型组小鼠不做处理。从实验第7天起,每天观察各组小鼠左耳皮损严重程度,于实验第7、10、12、15天,每天应用数字厚度测量仪测量所有小鼠左耳相同部位的皮肤厚度并记录数值。实验第15天,眼眶取血后颈椎脱臼法处死小鼠,分离左耳组织及颌下淋巴结。左耳一部分置于4%多聚甲醛固定,另一部分置于-80oC冻存。淋巴结置于4%多聚甲醛固定。采用HE染色观察各组小鼠左耳皮肤组织病理形态表现;采用TB染色计数各组小鼠左耳皮肤组织中肥大细胞数;采用免疫组织化学技术检测各组小鼠左耳皮肤组织中FLG和LOR表达水平;采用荧光定量PCR法检测各组小鼠左耳皮肤组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP m RNA表达水平。人永生化角质形成细胞株(Ha Ca T细胞),以含10%FBS,双抗(青霉素,100U/m L;链霉素,100μg/m L)的高糖DMEM培养液培养,培养条件:温度37℃,CO2浓度5%,隔日1:2传代。细胞培养至所需瓶数,根据研究目的将细胞进行分组。共分为四个检测部分进行相关指标检测。(1)不同浓度TFH对Ha Ca T细胞增殖活性的影响,采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性;(2)TFH对Ha Ca T细胞分泌细胞因子的筛查,采用细胞因子芯片技术,对各组细胞分泌的细胞因子进行筛查;(3)采用ELISA验证细胞因子芯片结果;(4)TFH对TNF-α/IFN-γ刺激Ha Ca T细胞MAPK-NF-κB信号通路的影响,采用Western-blot法检测各组细胞中p38、p-p38、ERK、p-ERK、NF-κB、p-NF-κB表达水平。结果:第一部分1肉眼观察显示:正常对照组小鼠左耳部皮肤在整个实验过程中均未见明显炎症损害表现。AD模型组小鼠左耳部皮肤于实验第7天开始出现红肿、粗糙、变硬,第14天开始出现表皮干燥和脱屑,随着激发次数增多,皮肤炎症症状逐渐加重,部分小鼠出现皮肤溃烂及出血。低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠皮肤炎症症状随着干预时间的延长逐渐改善。与正常对照组比较,AD模型组小鼠皮肤炎症评分显著升高,差异有统计学意义(p0.01),与AD模型组相比,低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠皮肤炎症评分显著降低,差异有统计学意义(p0.01)。2 HE染色结果显示:正常对照组小鼠左耳部皮肤结构规则,细胞形态正常,上皮层次清晰完整。AD模型组小鼠左耳部皮损处皮肤表皮角化过度伴随有部分区域角化不全,与正常对照组比较,AD模型组小鼠左耳上皮层厚度显著增加,差异有统计学意义(p0.01)。低剂量和高剂量沙棘果油干预组表皮仍可见轻度角化过度现象。与AD模型组比较,低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠左耳上皮层厚度显著变薄,差异有统计学意义(p0.01)。3 TB染色结果显示:与正常对照组比较,AD模型组、低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠左耳部皮肤组织中肥大细胞数均显著增多,差异有统计学意义(p0.01),与AD模型组比较,低剂量和高剂量沙棘果油干预组肥大细胞数均显著减少,差异有统计学意义(p0.01)。4各组小鼠血清Ig E水平检测显示:与正常对照组比较,AD模型组、低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠血清Ig E水平均增高,差异有统计学意义(p0.01或p0.05)。与AD模型组比较,低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠血清Ig E水平显著降低,差异有统计学意义(p0.01)。5各组小鼠颌下淋巴结质量显示:与正常对照组比较,AD模型组、低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠颌下淋巴结质量均增高,差异有统计学意义(p0.01或p0.05),与AD模型组比较,低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠颌下淋巴结质量均出现下降,差异有统计学意义(p0.01或p0.05)。6各组小鼠左耳组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP免疫组织化学染色结果平均光密度(AOD)检测显示:与正常对照组比较,AD模型组、低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠左耳组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(p0.01)。与AD模型组比较,低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠左耳组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(p0.01)。7各组小鼠颌下淋巴结中IL-4、IFN-γ和TNF-α的m RNA表达水平检测显示:与正常对照组比较,AD模型组、低剂量和高剂量沙棘果油干预组小鼠的IL-4、IFN-γ和TNF-α的m RNA表达水平都出现升高,差异有统计学意义(p0.01或p0.05)。与AD模型组比较,高剂量沙棘果油干预组小鼠的IL-4、IFN-γ和TNF-α的m RNA表达水平呈现出下降,差异有统计学意义(p0.01或p0.05)。与AD模型组比较,低剂量沙棘果油干预组小鼠的IFN-γ和TNF-α的m RNA表达水平明显下降,差异有统计学意义(p0.05)。8各组小鼠颌下淋巴结单细胞悬液中CD207/CD326、CD86、OX40和MHCⅡ阳性表达的细胞百分比检测结果显示:与正常对照组比较,AD模型组小鼠颌下淋巴结单细胞悬液中CD207/CD326、CD86、OX40和MHCⅡ阳性细胞所占的比例均显著升高,差异有统计学意义(p0.01)。与AD模型组比较,沙棘果油干预组小鼠颌下淋巴结单细胞悬液中CD207/CD326、CD86、OX40和MHCⅡ阳性细胞所占的比例均显著下降,差异有统计学意义(p0.01)。并且,各组阳性细胞下降的趋势与沙棘果油剂量呈相关性。第二部分1肉眼观察显示:正常对照组小鼠左耳部皮肤在整个实验过程中均未见明显炎症损害改变表现。AD模型组小鼠左耳部皮肤于实验第7天开始出现红肿、粗糙、变硬,随着涂抹MC903次数的增加,小鼠逐渐出现表皮干燥和脱屑,皮肤炎症症状日渐加重,个别小鼠左耳部皮肤出现溃烂和出血。基质组和AD模型组小鼠左耳部皮损表现无明显差别。TFH干预组小鼠皮肤炎症症状随着干预时间的延长逐渐改善,溃烂和出血表现减轻至消失。与正常对照组比较,AD模型组、基质组及TFH干预组小鼠左耳部皮肤炎症评分均显著增加,差异有统计学意义(p0.01);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠左耳部皮肤炎症评分显著降低,差异有统计学意义(p0.01),基质组小鼠左耳部皮肤炎症评分无统计学差异(p0.05)2各组小鼠左耳厚度测量结果显示:实验第7天,与正常对照组比较,AD模型组、基质组和TFH干预组小鼠左耳厚度显著增加,差异有统计学意义(p0.01)。实验第10天,与正常对照组比较,AD模型组、基质组和TFH干预组小鼠左耳厚度均显著增加,差异有统计学意义(p0.01);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠左耳厚度明显减小,差异有统计学意义(p0.05)。实验第12天和第15天,与正常对照组比较,AD模型组、基质组和TFH干预组小鼠左耳厚度均显著增加,差异有统计学意义(p0.01);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠耳厚度显著减小,差异有统计学意义(p0.01)。实验第7、10、12、15天,与AD模型组比较,基质组小鼠左耳厚度均无统计学差异(p0.05)。3 HE染色结果显示:正常对照组小鼠左耳部皮肤结构规则,细胞形态正常,上皮层次清晰完整。AD模型组小鼠左耳部皮损处皮肤表皮角化过度伴随有部分区域角化不全,与正常对照组比较,AD模型组小鼠左耳部皮损处上皮层厚度明显增加,差异有统计学意义(p0.01)。与AD模型组相比,TFH干预组小鼠左耳部皮损处上皮层厚度显著变薄,差异有统计学意义(p0.01),基质组小鼠上皮层厚度无统计学差异(p0.05)。4 TB染色结果显示:与正常对照组比较,AD模型组、基质组和TFH干预组小鼠左耳部皮肤组织中肥大细胞数均显著增多,差异有统计学意义(p0.01),与AD模型组相比,TFH干预组小鼠左耳部皮肤组织中肥大细胞数显著减少,差异有统计学意义(p0.01),基质组小鼠左耳部皮肤组织中肥大细胞数无统计学差异(p0.05)。5各组小鼠颌下淋巴结质量统计结果显示:与正常对照组比较,AD模型组、基质组、TFH干预组小鼠颌下淋巴结质量显著增大,差异有统计学意义(p0.01);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠颌下淋巴结质量显著减小,差异有统计学意义(p0.01),基质组小鼠颌下淋巴结质量无统计学差异(p0.05)。6各组小鼠左耳部皮损处皮肤组织中FLG、LOR表达水平检测显示:与正常对照组比较,AD模型组、基质组小鼠左耳部皮损处皮肤组织中FLG、LOR表达水平显著下调,差异有统计学意义(p0.01),TFH干预组小鼠左耳部皮损处皮肤组织中FLG、LOR表达水平无统计学差异(P0.05);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠左耳部组织中FLG、LOR表达水平显著上调,差异有统计学意义(p0.01);AD模型组和基质组比较,FLG、LOR的表达水平无统计学差异(p0.05)。7各组小鼠左耳部组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP m RNA表达水平检测显示:与正常对照组比较,AD模型组、基质组、TFH干预组小鼠左耳部组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP m RNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(p0.01);与AD模型组比较,TFH干预组小鼠左耳部组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α和及TSLP m RNA表达水平下调,差异有统计学意义(p0.01或P0.05),基质组IL-4、IFN-γ、TNF-α和TSLP m RNA表达水平无统计学差异(p0.05)。8不同浓度的TFH对Ha Ca T细胞增殖活性影响检测显示:与0mg·L-1 TFH组比较,仅2.5 mg·L-1 TFH组OD值呈现明显升高,差异有统计学意义(p0.05)。9细胞因子抗体阵列检测显示:与空白对照组比较,TNF-α/IFN-γ组细胞培养上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-3、MDC、PDGF-BB和TARC含量明显升高,差异有统计学意义(p0.05);与TNF-α/IFN-γ组比较,TNF-α+IFN-γ+TFH组细胞培养上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-3、MDC、PDGF-BB和TARC含量明显降低,差异有统计学意义(p0.05)。10 ELISA法检测各组细胞培养上清液中IL-6、MDC和TARC含量显示:与空白对照组比较,其余四组细胞培养上清液中IL-6、MDC、TARC的含量均显著升高,差异有统计学意义(p0.01);与TNF-α/IFN-γ模型组比较,不同浓度TFH干预组细胞培养上清液中IL-6、MDC、TARC的含量均显著降低,差异有统计学意义(p0.01);三个浓度的TFH干预组细胞培养上清液中IL-6、MDC、TARC的含量随TFH浓度增加而降低,呈量效关系。11 Western-blot法检测各组细胞p38、ERK、NF-κB蛋白及其磷酸化蛋白表达水平显示:各组细胞中p38、ERK和NF-κB蛋白表达水平无统计学差异(p0.05);与空白对照组比较,TNF-α/IFN-γ模型组中p-P38、p-ERK和p-NF-κB表达水平显著上调,差异有统计学意义(p0.01);与TNF-α/IFN-γ模型组比较,三个浓度TFH干预组细胞中p-p38、p-ERK和p-NF-κB表达水平显著下调,差异有统计学意义(p0.01),且呈量效关系。结论:1沙棘果油能够减轻AD小鼠皮肤局部炎症反应,降低AD小鼠由Ig E介导的超敏反应强度,抑制AD小鼠局部引流淋巴结的免疫应答强度。2沙棘果油通过抑制AD小鼠皮损部位皮肤组织中TSLP表达,进而抑制皮肤LCs的迁移和成熟,调节Th1/Th2平衡。3 TFH能够减轻AD小鼠皮肤局部炎症反应,抑制AD小鼠局部引流淋巴结的免疫应答强度。4 TFH上调AD小鼠皮损组织中FLG、LOR的表达水平,修复AD小鼠皮肤屏障。5 TFH通过抑制AD小鼠皮损部位皮肤组织中TSLP的表达,改善AD小鼠Th1/Th2失衡状态。6浓度为2.5 mg·L-1的TFH对Ha Ca T细胞具有促增殖作用。7 TFH通过MAPK-NF-κB信号通路抑制TNF-α/IFN-γ诱导的Ha Ca T炎症反应。