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脾虚证Ca~(2+)/CaM信号系统的实验研究

修宗昌  
【摘要】: 脾为后天之本,气血生化之源,在生命活动过程中占有重要地位。长期以来, 脾虚证一直是人们研究的热点。尤其近年来,中医证候动物模型研究的广泛开展, 加之分子生物学的兴起,为更深入探讨“脾虚”的本质奠定了理论基础。所以,我 们把“脾虚证Ca~(2+)/CaM信号系统的实验研究”纳入研究范围,立其为题。 目 的 寻求脾虚失运,化源亏乏,同空肠平滑肌细胞内Ca~(2+)/CaM信号系统的内在联 系。继而从胃肠动力学角度,对“脾主运化”的实质以及“脾虚失运”的发生机制 作出一个分子水平的诠释,并为阐明四君子汤的作用机理提供实验资料。 材料与方法 1、脾虚模型复制 将wistar大鼠按性别、体重随机分成3组,每组10只。①模型组:破气苦降 加饥饱失常法,即每日灌饲小承气汤煎剂,隔日半量进食;②正常对照组:常规饲 养,以等量生理盐水代替药物;③复健组:每日灌饲四君子汤煎剂,1~2h后,灌 饲小承气汤煎剂,余同模型组。共15天。 2、空肠平滑肌细胞悬液制备 将大鼠断头处死,在十二指肠与空肠交界处下1cm处剪取4cm长的肠组织, 剖开剥去浆膜与粘膜,洗净,剪碎,装入三角烧瓶内,加10ml消化液,通入100% 氧气,30℃,消化10min;共2次。消化毕,1800r/min离心5min,弃上清,加 HEPES-Ringer缓冲液洗涤2次,弃上清,再加入HEPES-Ringer缓冲液10ml,通 入氧气,30℃,振荡20min;而后用尼龙网(500μm)过筛,充氧气。 3、空肠平滑肌细胞内[Ca~(2+)]i测定 荧光法 一 取细胞悬液Zml,1800r/min离心 smin,用 Hanks液洗涤 2次,加 IMDM培养 液 Zml,振荡后加 10 ul含 Fura-2/AM(终浓度为 5 "in) 的 DMSO溶液;37’C水浴 摇床中经 Fura-二/AM负载 60min。弃上清,加 Hanks液洗 2次,1800r/min离心 smin。弃上清,加 IMDM培养液Zml,测定前将样品 37OC孵育2~3 min,在比色 杯内放入磁棒以防止细胞沉淀。最后用F3000荧光光度计测定荧光强度,其中激 发波长为 340urn,发射波长为 500urn,反应时间 2 min。结果以下式算出: [Ca’”二=224 X(F-F min)/(Fmax-F) 式中,F为静息荧光值,F min为加 EGTA后的荧光值,Fmax为加 tritonx.100 后的荧光值。 4、空肠平滑肌细胞内CaM活性测定 磷酸H酯酶(PDE)法 山制备PDE 新鲜小牛脑除去小脑、被膜、血管等,取150g于1000ml缓冲 液中匀浆,20000 X g4℃离心lh,上清过DEAE6ephadex-A50柱,NaCI线型梯度 洗脱,收集第二个活性峰处酶液,透析后,上DEAE一纤维素DE52柱,NaCI线 型梯度洗脱,收集活性峰处酶液,透析后分装,80 t保存。 (2)P*E活性检测①酶促反应过程:②孔雀石绿定磷法测定无机磷:绘制 磷标准曲线,未知样品磷摩尔数可以从曲线上查得。按下式计算PDE 活性(V molpi.min): 测定管磷含量(ug)一对照管磷含量(ug) — —XZ 30.97x30xPDE(mg) m标准 CaM的制备及其标准曲线制作①取新鲜小牛脑 1009,如*)处理干 净,加入缓冲液,高速匀浆。浆液搅拌 lh后离心,保留上清。②将离心上清用 6mol/L 醋酸调PH为4.3,10min后加硫酸镣至饱和度为50%,PH不变。放置lh后离 心,弃去上清。加入 200ml缓冲液,用 lmol/L Tris调 PH至 7.5,离心,保留上 -“清。③将离心上清过用缓冲液平衡的DEAE一纤维素DE52柱,并进行梯度洗脱, 测各管 OD。s沪合并第 2个蛋白洗脱峰,同上透析,浓缩便得纯化 CaM。将其以 0.l% BSA配成浓度为0.05%,测其对PDE的激活作用。④绘制CaM激活PDE标准曲 线 (4)样品中 CaM含量测定 取 0.sml 细胞悬液在电磁搅拌器上磨 30s,4 oC 1300r/min 离心30nin,上清于100℃水中煮Zmin,冷却后11300r/min4℃离心 8 一 10min,上清用标难曲线制作法测定CaM 含量。绘出激活曲线,选择灵敏点 (OD660)查出待测样品中CaM活性。 5、统计学处理:采用t检验。 结果 1、脾虚动物模型塑造 模型组自第3天起出现泄泻体重下降。此后至造模结束,渐现便搪加重,倦 乏拱背,毛乱乏泽,纳少等脾虚症状,肛温下降不显(P>0.05);复健组偶见便 搪,毛略欠泽,体重缓慢增加(P


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