脾虚证Ca～(2+)/CaM信号系统的实验研究

【摘要】： 脾为后天之本，气血生化之源，在生命活动过程中占有重要地位。长期以来， 脾虚证一直是人们研究的热点。尤其近年来，中医证候动物模型研究的广泛开展， 加之分子生物学的兴起，为更深入探讨“脾虚”的本质奠定了理论基础。所以，我 们把“脾虚证Ca~(2+)/CaM信号系统的实验研究”纳入研究范围，立其为题。 目 的 寻求脾虚失运，化源亏乏，同空肠平滑肌细胞内Ca~(2+)/CaM信号系统的内在联 系。继而从胃肠动力学角度，对“脾主运化”的实质以及“脾虚失运”的发生机制 作出一个分子水平的诠释，并为阐明四君子汤的作用机理提供实验资料。 材料与方法 1、脾虚模型复制 将wistar大鼠按性别、体重随机分成3组，每组10只。①模型组：破气苦降 加饥饱失常法，即每日灌饲小承气汤煎剂，隔日半量进食；②正常对照组：常规饲 养，以等量生理盐水代替药物；③复健组：每日灌饲四君子汤煎剂，1～2h后，灌 饲小承气汤煎剂，余同模型组。共15天。 2、空肠平滑肌细胞悬液制备 将大鼠断头处死，在十二指肠与空肠交界处下1cm处剪取4cm长的肠组织， 剖开剥去浆膜与粘膜，洗净，剪碎，装入三角烧瓶内，加10ml消化液，通入100％ 氧气，30℃，消化10min；共2次。消化毕，1800r/min离心5min，弃上清，加 HEPES-Ringer缓冲液洗涤2次，弃上清，再加入HEPES-Ringer缓冲液10ml，通 入氧气，30℃，振荡20min；而后用尼龙网（500μm）过筛，充氧气。 3、空肠平滑肌细胞内[Ca~(2+)]i测定 荧光法 一 取细胞悬液Zml，1800r／min离心 smin，用 Hanks液洗涤 2次，加 IMDM培养 液 Zml，振荡后加 10 ul含 Fura－2／AM（终浓度为 5 ＂in） 的 DMSO溶液；37’C水浴 摇床中经 Fura－二／AM负载 60min。弃上清，加 Hanks液洗 2次，1800r／min离心 smin。弃上清，加 IMDM培养液Zml，测定前将样品 37OC孵育2～3 min，在比色 杯内放入磁棒以防止细胞沉淀。最后用F3000荧光光度计测定荧光强度，其中激 发波长为 340urn，发射波长为 500urn，反应时间 2 min。结果以下式算出： ［Ca’”二＝224 X（F－F min）／（Fmax－F） 式中，F为静息荧光值，F min为加 EGTA后的荧光值，Fmax为加 tritonx．100 后的荧光值。 4、空肠平滑肌细胞内CaM活性测定 磷酸H酯酶（PDE）法 山制备PDE 新鲜小牛脑除去小脑、被膜、血管等，取150g于1000ml缓冲 液中匀浆，20000 X g4℃离心lh，上清过DEAE6ephadex－A50柱，NaCI线型梯度 洗脱，收集第二个活性峰处酶液，透析后，上DEAE一纤维素DE52柱，NaCI线 型梯度洗脱，收集活性峰处酶液，透析后分装，80 t保存。 （2）P＊E活性检测①酶促反应过程：②孔雀石绿定磷法测定无机磷：绘制 磷标准曲线，未知样品磷摩尔数可以从曲线上查得。按下式计算PDE 活性（V molpi．min）： 测定管磷含量（ug）一对照管磷含量（ug） — —XZ 30．97x30xPDE（mg） m标准 CaM的制备及其标准曲线制作①取新鲜小牛脑 1009，如＊）处理干 净，加入缓冲液，高速匀浆。浆液搅拌 lh后离心，保留上清。②将离心上清用 6mol／L 醋酸调PH为4．3，10min后加硫酸镣至饱和度为50％，PH不变。放置lh后离 心，弃去上清。加入 200ml缓冲液，用 lmol／L Tris调 PH至 7．5，离心，保留上 －“清。③将离心上清过用缓冲液平衡的DEAE一纤维素DE52柱，并进行梯度洗脱， 测各管 OD。s沪合并第 2个蛋白洗脱峰，同上透析，浓缩便得纯化 CaM。将其以 0．l％ BSA配成浓度为0．05％，测其对PDE的激活作用。④绘制CaM激活PDE标准曲 线 （4）样品中 CaM含量测定 取 0．sml 细胞悬液在电磁搅拌器上磨 30s，4 oC 1300r／min 离心30nin，上清于100℃水中煮Zmin，冷却后11300r／min4℃离心 8 一 10min，上清用标难曲线制作法测定CaM 含量。绘出激活曲线，选择灵敏点 （OD660）查出待测样品中CaM活性。 5、统计学处理：采用t检验。 结果 1、脾虚动物模型塑造 模型组自第3天起出现泄泻体重下降。此后至造模结束，渐现便搪加重，倦 乏拱背，毛乱乏泽，纳少等脾虚症状，肛温下降不显（P＞0．05）；复健组偶见便 搪，毛略欠泽，体重缓慢增加（P