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肾虚骨质疏松大鼠和成骨细胞中TGF-β_1及其信号转导分子Smad2、4基因调控机制

任艳玲  
【摘要】: 目的:研究TGF—β_1及其信号转导分子Smad2、4基因及蛋白在肾虚骨质疏松症大鼠及体外培养的新生大鼠颅盖骨成骨细胞中的调控机制,探讨肾虚骨质疏松症的病因病机及防治机理。 材料与方法:实验分体内、体外实验两部分。体内实验部分采用切除大鼠双侧卵巢的方法复制肾虚骨质疏松症模型,同时应用益气补精、补肾壮骨的中药密骨颗粒剂大、中、小剂量组12周进行反证,用骨疏康颗粒剂、尼尔雌醇作为阳性对照,正常大鼠和模型空白组为空白对照组;用双能X线骨密度仪检测离体骨密度,用生化或放免方法对血清中碱性磷酸酶、抗酒石酸性酸性磷酸酶、骨钙素、雌激素、钙、镁、磷,24h尿中的钙、肌酐、羟脯氨酸进行检测;用HE方法观察骨组织形态计量学;用酶联免疫吸附法(Elisa)检测大鼠血清中TGF—β_1活性;用免疫组化方法、RT—PCR法、Western印迹法检测骨组织中TGF—β_1、Smad2、4 mRNA及其蛋白的表达。体外实验部分进行新生大鼠颅盖骨成骨细胞的培养,采用Gomori改良钙钴法测定细胞的碱性磷酸酶的表达,加防治后药物血清用MTT检测成骨细胞增殖,免疫组化方法检测成骨细胞的TGF—β_1、Smad2、4的蛋白表达及细胞内定位,RT—PCR检测成骨细胞TGF—β_1、Smad2、4的mRNA表达。 结果:1.体内实验:(1)实验动物子宫指数比较:模型空白组子宫指数较正常组明显降低,密骨颗粒各剂量组、骨疏康组较模型组虽有所升高,但无显著性差异,尼尔雌醇组可显著提高子宫指数。(2)各组骨组织病理形态学比较:HE染色光镜下观察各组大鼠右后肢胫骨上端松质骨部分显示,正常组可见骨小梁形态结构完整,排列规则;模型组骨小梁结构排列稀疏,出现大量骨小梁盲端,骨小梁厚度(Tb.Th)缩小,髓腔面积百分率(%Ma.Ar)明显增大;密骨颗粒各剂量组,骨疏康和尼尔雌醇组骨小梁数增多,骨小梁增宽,结构排列较紧密,Tb.Th增加,%Ma.Ar明显缩小。(3)实验动物血尿生化指标的比较:各组血清Ca、P、Mg,尿Ca/Cr无显著性差异;与正常组比较,模型空白组血清BGP、TRAP、ALP活性、尿Hop/Cr比值显著升高,血清E_2水平显著降低;与模型空白组比较,密骨颗粒各剂量组、及骨疏康和尼尔雌醇组的血清BGP、ALP的活性显著降低,TRAP活性虽也显著降低,但仍未达到正常组水平,尿Hop/Cr显著降低。(4)实验动物离体股骨及胫骨骨密度的比较:模型空白组大鼠右后下肢离体股骨整体、股骨近端、股骨远端、胫骨近端的骨密度显著下降,胫骨整体骨密度虽也有下降趋势,但无显著性差异;密骨颗粒各剂量组、及骨疏康、尼尔雌醇组均可明显增加股骨整体、股骨近端、股骨远端、胫骨近端的骨密度。(5)实验动物血清TGF-β_1活性的变化:模型空白组血清中TGF—β_1活性显著下降,密骨颗粒各剂量组、骨疏康组和尼尔雌醇组防治用药12周后,可显著提高血清中TGF—β_1活性。(6)骨组织中的TGF—β_1免疫组化:正常组TGF—β_1主要表达于骨小梁周围的成骨细胞、骨基质,其中主要定位于成骨细胞胞浆,胞核也有淡染。(7)RT—PCR及Western方法检测,模型空白组骨组织中的TGF—β_1、Smad2、4基因及蛋白表达水平下调,密骨颗粒各剂量组、骨疏康及尼尔雌醇对照组防治用药后,可明显上调其mRNA及其蛋白表达。2.体外实验:(1)用酶消化法进行大鼠成骨细胞培养,方便易行,可培养大量高纯度成骨细胞供研究使用。(2)密骨颗粒各剂量组、骨疏康和尼尔雌醇对照组药物血清作用48h后可明显促进成骨细胞的增殖。(3)免疫组化及RT—PCR表明成骨细胞存在TGF 辽宁中医学院博士学位论文 DOCton蛇eP即盯ofLiaoningCollegeofT咧妞ionalChin。翎Medicin。 一pl及其信号转导系统SmadZ、4,并主要表达于成骨细胞胞浆内。(4)密骨颗粒各剂量组、 骨疏康和尼尔雌醉组药物血清作用48h后可上调TGF一p:及SmadZ、4蛋白及其mRNA表 达水平,同时发生SmadZ、4由胞浆转位至核内现象。 结论:(1)采用切除大鼠双侧卵集方法可以成功复制肾虚骨质疏松症模型。(2)采用 药物血清作用于体外培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞的方法是较为稳定可靠的血清药理学 方法。③正常大鼠股骨干髓端组织可以在基因、蛋白水平表达TGF一p:及其信号转导分 子SmadZ、4,表明正常骨组织存在TGF一p.的SmadZ、4信号转导途径,其蛋白表达水平 与TGF一山蛋白表达水平呈正相关,可能介导TGF一日在维持骨密度中起重要作用。(4)体 外培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞中也存在TGF一p:及其信号转导系统.(5)肾虚骨质疏松 大鼠表现为雌激素减少,骨密度下降,骨吸收与骨形成均加速,呈高转换型骨代谢。(6) TGF 一p:及其信号转导分子SmadZ、4的mRNA、蛋白表达水平的下调,以及成骨细胞对其反 应性降低可能是肾虚骨质疏松症发生的重要机制之一。(7)益气生精、补肾壮骨方药可以 纠正肾虚骨质疏松症的高骨转换率,改普骨吸收与骨形成偶联失衡状况,同时促进了骨 形成,抑制骨吸收,.对于以松质骨丢失为主,高转换型的肾虚骨质疏松症有一定的防治 作用;而且中药各组之间有一定的童效关系,商、中剂量组优于低剂t组.(8)’益气生精、 补肾壮骨方药通过在转录、翻译水平调节几F一p 1.及其信号转导分子SmadZ、4的表达,


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