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人参皂苷Rg1对抗脑缺血再灌注细胞凋亡及p-JNK表达的实验研究

包翠芬  
【摘要】: 目的:明确人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注损伤的保护作用,进一步探讨人参皂苷Rg1调控JNK及其效应分子的表达、抑制神经元凋亡、发挥神经保护作用的机制。 材料与方法:健康SD大鼠(250~300g)随机分为假手术组、单纯缺血再灌注组(以下简称:模型组)、模型+人参皂苷Rg1治疗组(以下简称:人参皂苷Rg1组)、模型+尼莫地平1 mg/kg阳性药物治疗组(以下简称:阳性药物对照组),其中人参皂苷Rg1组又分为3个亚组(10、20、40 mg/kg组),每组35只。实验模型采用阻断大鼠大脑中动脉致局灶性脑缺血再灌注(MCAO)模型,分别选用栓塞2小时后再灌注4小时、22小时作为观察时间。人参皂苷Rg1各组于术前5天至取材当日分别注射10、20、40 mg/kg的人参皂苷Rg1,阳性药物对照组给予1 mg/kg的尼莫地平,假手术组及模型组给予等体积等渗生理盐水。MCAO术后24小时,通过神经功能评分观察各实验组大鼠神经功能缺损症状的改善情况,动物处死后采用TTC染色观察大鼠脑梗死体积变化,利用干湿重法观察大鼠脑水肿情况,采用HE染色观察大鼠右侧海马CA1区的病理学变化,采用电镜技术观察CA1区神经元超微结构的改变,利用TUNEL法检测CA1区神经元凋亡率,采用Nissl染色观察CA1区神经元尼氏体的变化,计数存活神经元数量,采用免疫组织化学及免疫印迹方法对CA1区的线粒体途径(Bcl-2、Bax)及死亡受体途径(FAS、FAS-L)的凋亡相关蛋白表达情况进行检测,并利用细胞图像分析系统对其进行定量分析。于MCAO术后6小时,采用免疫组织化学及免疫印迹方法对CA1区的p-JNK蛋白表达及其下游效应分子c-jun的活化情况进行检测,并利用细胞图像分析系统对其进行定量分析。 结果: 1.人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注的保护作用 (1)假手术组、模型组、人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组神经功能评分分别为0.00±0.00、2.80±0.58、1.96±0.74、1.52±0.82、1.24±0.72、1.44±1.00;与模型组比较,人参皂苷Rg1各组神经功能缺损症状显著改善(P<0.05);Rg110 mg/kg组大鼠神经功能缺损症状虽然减轻,但与阳性药物对照组比较仍有显著性差异(P<0.05),而20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P>0.05);Rg1组间比较有显著性差异(P<0.05),其中以Rg1 40 mg/kg组改善神经功能缺损症状的程度最为明显。 (2)假手术组、模型组、人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组脑梗死体积百分比分别为(0.00±0.00)%、(36.20±5.77)%、(27.86±3.72)%、(20.24±3.37)%、(15.72±2.83)%、(18.08±3.78)%;Rg1各组脑梗死体积显著缩小,与模型组比较有显著性差异(P<0.05);Rg1 10 mg/kg组大鼠脑梗死体积虽然减少,但与阳性药物对照组比较仍有显著性差异(P<0.05),而20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P<0.05);Rg1 20、40 mg/kg组与10 mg/kg组比较均有显著性差异(P<0.05),其中以Rg1 40 mg/kg组脑梗死体积减少的程度最为明显。 (3)假手术组、模型组、Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组脑组织含水量分别为(77.77±1.50)%、(83.42±2.75)%、(81.78±1.10)%、(80.77±0.76)%、(78.80±0.78)%、(81.13±1.64)%;Rg1 20、40 mg/kg组脑组织含水量显著减少,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),其中以40 mg/kg组脑水肿减轻的程度最为明显;Rg1 10mg/kg组大鼠脑组织含水量虽然减少,但与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。 (4) Rg1各组右侧海马CA1区细胞排列较整齐,间质水肿程度减轻,神经元胞体肿胀减轻,与模型组比较各项病理改变均有不同程度的改善。 2.人参皂苷Rg1抑制脑缺血再灌注大鼠海马CA1区的神经元凋亡 (1)模型组部分神经元坏死,也可见不同时期的神经元凋亡,有时可见凋亡小体形成;Rg1各组与模型组比较,粗面内质网肿胀及线粒体嵴断裂程度均有不同程度的减轻,可见少量早期凋亡细胞,中晚期凋亡细胞较少见。 (2)假手术组、模型组、Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组海马CA1区神经元凋亡率分别为(1.91±1.46)%、(22.80±5.15)%、(17.08±3.15)%、(14.45±3.22)%、(9.70±1.91)%、(12.42±1.93)%;Rg1各组海马CA1区的凋亡细胞数量显著降低,与模型比较有显著性差异(P<0.05);Rg1 10、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较均有显著性差异(P<0.05),其中40 mg/kg组抑制凋亡的程度显著优于阳性药物对照组,而20mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P>0.05)。 (3)假手术组、模型组、Rg1 10、20、40 mg/kg组海马CA1区存活神经元计数分别为每高倍视野71.57±9.37、45.77±8.11、50.20±10.21、54.37±8.50、59.77±7.88、56.50±8.91;Rg1 20、40 mg/kg组神经元存活数量得到不同程度地提高,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),而Rg1 10 mg/kg组神经元存活数量虽然有所增高,但与模型组比较无显著性差异(P>0.05);Rg1各组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P>0.05)。 (4)假手术组、模型组、人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组海马CA1区Bcl-2蛋白表达含量分别为1.54±0.06、1.39±0.76、1.72±0.21、2.76±0.15、4.31±0.89、3.11±0.19,Bax蛋白表达含量分别为0.30±0.07、4.31±0.55、2.21±0.12、1.80±0.20、0.93±0.08、1.57±0.09;免疫组织化学与免疫印迹结果显示Rg1 20、40mg/kg组Bcl-2蛋白表达量显著增强,Rg1各组Bax蛋白含量显著降低,Bcl-2/Bax比值显著提高,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。 (5)人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组海马CA1区FAS蛋白表达含量分别为0.28±0.05、3.01±0.24、1.76±0.12、1.51±0.60、1.31±0.13、1.53±0.15,FAS-L蛋白表达含量分别为0.14±0.02、0.86±0.19、0.72±0.06、0.62±0.16、0.29±0.09、0.52±0.18;Rg1各组FAS、FAS-L平均灰度明显增高(表达量减少),蛋白含量显著降低,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),其中40 mg/kg组FAS、FAS-L蛋白含量最低;10 mg/kg组与阳性药物对照组比较有显著性差异(P<0.05),而20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P>0.05)。 3.人参皂苷Rg1抑制脑缺血再灌注大鼠p-JNK、p-c-jun表达: (1)假手术组、模型组、人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组海马CA1区p-JNK蛋白表达含量分别为1.21±0.39、2.27±0.28、2.21±0.27、1.93±0.30、1.64±0.31、1.85±0.41;人参皂苷Rg1各组p-JNK蛋白含量显著降低,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),其中10 mg/kg组p-JNK蛋白含量最高,40 mg/kg组p-JNK蛋白含量最低;10、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较有显著性差异(P<0.05),而20 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P>0.05)。 (2)假手术组、模型组、人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组海马CA1区p-c-jun蛋白表达含量分别为0.51±0.07、2.02±0.17、1.21±0.11、0.87±0.22、0.69±0.07、0.80±0.18;模型组大鼠p-c-jun含量最高,假手术组p-c-jun含量最低;人参皂苷Rg1 20、40 mg/kg组p-c-jun蛋白含量显著降低,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),其中40 mg/kg组p-c-jun蛋白含量最低;人参皂苷Rg1 10 mg/kg组与阳性药物对照组比较有显著性差异(P<0.05),而Rg1 20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P>0.05)。 结论: 1.人参皂苷Rg1可以显著改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损症状。 2.人参皂苷Rg1能显著降低脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经元凋亡率;进一步研究显示Rg1可能通过抑制脑缺血后海马CA1区的JNK及其效应分子c-jun的活化,进一步调节死亡受体、线粒体依赖的凋亡途径,抑制脑缺血再灌注后的神经元凋亡,降低缺血后迟发性神经元死亡,控制缺血半暗带向梗死区的发展,以发挥其对脑缺血再灌注损伤的保护作用。


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