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加味小柴胡汤干预大鼠哮喘模型的实验研究

赵克明  
【摘要】: 目的:在建立支气管哮喘大鼠模型的基础上,给予加味小柴胡汤干预,通过动物实验,从病理学、免疫组织化学和分子生物学等多角度探讨中药加味小柴胡汤治疗支气管哮喘大鼠模型作用机制,为临床治疗支气管哮喘用药提供实验依据。 方法: 第一部分加味小柴胡汤对哮喘大鼠支气管病理组织学观察 在适应性饲养之后,将60只大鼠随机分为6组,即正常组、模型组、中药加味小柴胡汤高剂量组(简称高剂量组)、中药加味小柴胡汤低剂量组(简称低剂量组)、西药地塞米松注射液组、中药加味小柴胡汤加西药地塞米松注射液组(简称中西药组),每组10只。对各只大鼠分别标记号码,组间平均体重差控制在20g,进行药物干预实验。各治疗组均从第1次哮喘激发开始(造模第3周)至处死前每天灌胃给药,连续4周,正常组用生理盐水灌胃,各组均每7天复查动物体重。 参考相关文献,将大鼠适应性饲养3天后,除正常组外,于实验第1天和第8天各组大鼠腹腔内注射10%卵蛋白、氢氧化铝混合液1ml,腰部两侧各取1点,每点皮下注射0.5 ml,共计2 ml,使大鼠致敏。第15天起用3%卵蛋白40 ml喷雾激发大鼠哮喘发作,雾化流量控制在5ml∕分钟,每次15分钟,隔日一次,共激发4周。以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、点头呼吸及站立不稳等表现为激发成功。正常对照组以生理盐水代替卵蛋白进行腹腔注射及雾化吸入。 动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取右肺中叶4%多聚甲醛固定,脱水、包埋、切片,苏木精-伊红HE染色,镜下观察病理学改变。 造模之前测量一次大鼠体重;造模开始后每7天测一次大鼠体重,直至取材之前进行最后一次测量;大鼠激发四周后计数1分钟内呼吸频率和打喷嚏的次数。 所有数据均用SPSS10.0统计分析软件处理。实验数据以均数±标准差( x±s)表示,组间采用单因素方差分析(Bonferroni)的方法进行统计分析。显著性差异水平以0.05和0.01为标准。 第二部分加味小柴胡汤对支气管哮喘大鼠血清中炎性介质NO(一氧化氮)和ET-1(内皮素1)的影响 动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。在实验的第42天,最后一次哮喘激发后称重,并进行大鼠腹主动脉取血,用于测定一氧化氮、内皮素-1。采用硝酸还原酶法测定肺组织NO含量。由于NO化学性质活泼,在体内代谢很快转为NO2-和NO3-,而NO2-又进一步转化为NO3-,本法利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-,通过显色深浅测定其浓度的高低。采用放免法测定肺组织ET-1含量。由自动γ-放射免疫计数器预先编制程序,直接给出标准曲线及样品浓度。 第三部分加味小柴胡汤对支气管哮喘大鼠肺组织中细胞因子白介素(IL)-4和γ干扰素(IFN-γ)的调节作用 动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取右肺上叶,称重后移入玻璃匀浆管中,加入2倍肺组织重量的生理盐水,充分研碎,使组织匀浆化。制备好的匀浆3500r/min,离心10 min,提取上清液分装,低温冰箱保存待测。白介素(IL)-4和γ-干扰素(IFN-γ)测定采用酶联免疫吸附方法(ELISA)。 第四部分加味小柴胡汤对支气管哮喘大鼠外周血及肺组织中EOS的影响 动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取右肺中叶4%多聚甲醛固定,脱水、包埋、切片,苏木精-伊红HE染色,镜下观察肺组织中EOS浸润改变。 第五部分加味小柴胡汤对支气管哮喘大鼠肺组织中IL-5 mRNA表达的影响 动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取近肺门处的右肺约100mg,放入Eppendorf管,加入1ml Trizol充分匀浆,投入液氮罐,待测RT-PCR。采用RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中IL-5 mRNA表达的变化。 结果: 1.成功复制大鼠支气管哮喘模型。 2.哮喘模型组肺组织支气管及血管旁有大量的EOS浸润,符合哮喘慢性炎症过程中的病理改变。加味小柴胡汤高低剂量组均能减少肺组织EOS浸润,尤其加味小柴胡汤高剂量组EOS减少更为明显,作用优于哮喘模型组和加味小柴胡汤低剂量组。 3.各实验组大鼠体重的变化:在致敏前、激发前、激发两周、激发四周各时间点中,激发前后正常组和加味小柴胡汤低剂量组、加味小柴胡汤高剂量组、中药加味小柴胡汤加西药地塞米松注射液组、地塞米松注射液组大鼠体重没有差异(P 0.05);激发两周后模型组大鼠体重明显低于正常组、加味小柴胡汤高剂量组、中药加味小柴胡汤加西药地塞米松注射液组,差异显著(P0.01);激发四周后模型组大鼠体重明显低于正常组、加味小柴胡汤高剂量组、中药加味小柴胡汤加西药地塞米松注射液组(P0.01),低于地塞米松注射液组(P0.05)。各实验组大鼠呼吸频率和打喷嚏次数的变化:激发四周后,与模型组比较,模型组大鼠的呼吸频率和打喷嚏次数明显高于其他各组。 4.与空白组比较,模型组NO水平显著升高(P0.05),其余各组没有显著差异(P0.05)。与模型组比较,西药组,中药高剂量组、中药加西药组NO水平显著降低(P0.05)。西药组,中药加西药组、中药低剂量组和中药高剂量组组进行组间比较没有显著差异(P0.05)。与空白组比较,模型组、西药组,中药高剂量组、中药加西药组和中药低剂量组ET1水平显著升高(P0.01);与模型组比较,西药组,中药高剂量组、中药加西药组和中药低剂量组ET1水平都显著降低(P0.01)。西药组,中药高剂量组、中药加西药组和中药低剂量组ET1水平进行组间比较没有显著差异(P0.05)。 5.与模型组比较,加味小柴胡汤高剂量组均可明显降低IL-4含量,具有非常显著性差异(P0.01);而正常组和加味小柴胡汤低剂量组、加味小柴胡汤高剂量组、中药加味小柴胡汤加西药地塞米松注射液组、地塞米松注射液组之间大鼠肺组织匀浆IL-4含量没有差异(P 0.05)。与模型组比较,加味小柴胡汤高剂量组、加味小柴胡汤低剂量组和加味小柴胡汤加西药地塞米松注射液组可明显升高IFN-γ含量,具有非常显著性差异(P0.01),西药组也可升高IFN-γ含量,但是无显著性差异(P0.05);与正常组比较,西药组和模型组IFN-γ含量较低,具有非常显著性差异(P0.01);与西药组比较,中药加味小柴胡汤加西药地塞米松注射液组可明显升高IFN-γ含量,具有显著性差异(P0.01),加味小柴胡汤高剂量组和加味小柴胡汤低剂量组也可明显升高IFN-γ含量,具有显著性差异。 6.与模型组比较,西药组,中药高剂量组、中药加西药组肺支气管组织EOS计数显著降低(P0.01),中药低剂量组肺支气管组织EOS计数也明显降低(P0.05)。西药组,中药加西药组、中药低剂量组和中药高剂量组组进行组间比较没有显著差异,无统计学意义(P0.05)。与模型组比较,西药组,中药高剂量组、中药加西药组外周血中EOS计数显著降低(P0.01),中药低剂量组外周血EOS计数也明显降低(P0.05)。西药组,中药加西药组、中药低剂量组和中药高剂量组组进行组间比较没有显著差异,无统计学意义(P0.05)。 7.哮喘模型组肺组织IL-5 mRNA表达较正常组明显增高(P0.01),与模型组比较,中药高剂量组、中药加西药组肺组织IL-5 mRNA的表达明显降低(P0.01),与西药组比较,中药高剂量组、中药加西药组肺组织IL-5 mRNA的表达明显降低(P0.01),与中药低剂量组比较,中药高剂量组、中药加西药组肺组织IL-5 mRNA的表达明显降低(P0.01),中药高剂量组与中药加西药组之间肺组织IL-5 mRNA的表达无显著差异(P0.05)。 结论: 1.采用皮下多点注射卵蛋白(OVA)的方法,成功诱导大鼠支气管哮喘模型。 2.各治疗组明显改善大鼠的一般状态,哮喘模型组肺组织支气管及血管旁有大量的EOS浸润,符合哮喘慢性炎症过程中的病理改变。加味小柴胡汤高低剂量组均能减少肺组织EOS浸润,尤其加味小柴胡汤高剂量组EOS减少更为明显,作用优于哮喘模型组和加味小柴胡汤低剂量组,可见加味小柴胡汤能有效抑制嗜酸性粒细胞浸润,减轻气道炎症,降低气道的高反应性,为加味小柴胡汤有效治疗哮喘提供了有利依据。 3.加味小柴胡汤显著降低血中NO的表达。高、低剂量组加味小柴胡汤均能降低血中NO水平,但二者无显著差异。加味小柴胡汤可以很好地降低血中ET-1水平,从而抑制哮喘炎症的发展,防止或延缓气道重塑。 4.支气管哮喘模型组大鼠肺组织IL-4含量较正常组显著升高。,与模型组比较,各治疗组均能降低肺组织IL-4含量,提高IFN-γ含量,说明加味小柴胡汤可通过降低肺组织IL-4含量,提高IFN-γ含量,从而调节免疫功能,减轻EOS对气道浸润,控制气道炎症。 5.加味小柴胡汤可明显降低外支气管哮喘大鼠外周血、肺支气管中EOS的数量,可减轻哮喘动物模型的气道炎性细胞的浸润,同时可减轻哮喘动物模型的外周血炎性细胞的聚集。 6.IL-5参与了支气管哮喘的发病及气道炎症,加味小柴胡汤高剂量组、中药加西药组肺组织IL-5 mRNA的表达明显降低,加味小柴胡汤可从转录水平降低肺组织IL-5mRNA的表达,促进肺内EOS凋亡,减少炎细胞浸润,从而减轻了哮喘气道炎症,缓解哮喘气道痉挛。


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