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利用基因工程手段提高两种微藻的生物量与特定代谢产物产量

闫晋飞  
【摘要】:用基因工程手段提高裂壶藻生长速度和脂肪酸含量 裂壶藻(Schizochytrium sp.)又称裂殖壶菌,属不等鞭毛门(Stramenopiles),是一种异养微藻。裂壶藻合成丰富的多不饱和脂肪酸,其二十碳五烯酸(timnodonic acid, DPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)占总脂肪酸60%以上,占细胞干重的43%,是用于工业发酵生产长链多不饱和脂肪酸的几种非常理想的异养真核微藻之一。 目前,利用裂壶藻生产长链多不饱和脂肪酸面临的主要问题之一是在高密度发酵过程中,葡萄糖转化后积累出的乙酸会对发酵过程微生物产生负面影响。为解决这一难题,我们拟通过电击转化法将大肠杆菌中的乙酰辅酶A合成酶基因(acetyl-coA synthetase,ACS)引入到海洋裂壶藻Schizochytrium sp. TIO1101中。对转化子进行PCR、Southern和Western免疫印迹检测的结果显示:外源ACS基因转化成功并在传代过程中稳定表达。摇瓶培养及高密度发酵实验的检测结果显示:外}源ACS基因表达可以降低培养基醋酸浓度,增加细胞内乙酰辅酶A库存,显著提高生物量和脂肪酸含量。以上结果表明,过表达ACS促进了裂壶藻三羧酸循环方向的代谢,降低了乙酸的积累,能显著提升DHA的产量。证明引入的ACS对改善裂壶藻代谢方面确实有重要意义。 雨生红球藻遗传转化研究 雨生红球藻Haematococcus pluvialis)是一种单细胞绿藻,新形成细胞体积较小,呈球形或卵圆形,黄绿色,有两根鞭毛。雨生红球藻则是属于绿藻门(Chlorophata),绿藻纲(Chlorophyceae),团藻目(Volvocales),红球藻科Haematococcaceae),红球藻属(Haematococcus)。微藻是天然虾青素重要的来源之一。微藻中虾青素含量最高的是雨生红球藻,也是所有已知能积累虾青素生物体中合成量最高的物种,其合成量最高可达细胞干重的4%。 在转基因裂壶藻的基础上,结合以前的经验教训,分别用农杆菌侵染法和基因枪法对雨生红球藻做了外源基因稳定表达的实验尝试。同时从启动子,报告基因,抗性筛选基因和目的基因的组合方面进行考虑,构建了多个质粒。通过荧光标记验证,抗性筛选,PCR鉴定,结果证明农杆菌侵染法和基因枪法均可将外源基因导入雨生红球藻。由于雨生红球藻自身的生物特性及实验设计的复杂程度,未来将对外源蛋白的定位,功能性验证等方面进行深入研究,并将是实验室未来的一个长期的研究方向。


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