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肝再生增强因子对刀豆蛋白A诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用研究

穆矛  
【摘要】:肝脏是人体最大的消化器官。由于消化功能的需要,肝脏持续的接收来自胃肠道的血液,这些血液中含有大量的外来抗原。为了抵御外来抗原,肝脏内网状的肝血窦周围含有大量的免疫细胞,存在复杂的免疫反应。为了保护自身细胞不被过激的免疫反应所伤害,肝脏处于免疫排斥和免疫耐受的平衡状态。病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等多种肝脏疾病的发生与发展均与肝脏免疫失衡有关。研究肝脏中的免疫调节物质对肝脏疾病的预防及治疗都具有非常重要的意义。肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)是一种具有热稳定性,无种属特异性的小分子蛋白。先前ALR的研究主要集中在促进肝细胞再生、抑制细胞凋亡和促进线粒体基因表达等方面。外源性给予重组ALR蛋白能够改善药物性肝损伤、肝硬化和实验性肝纤维化大鼠肝脏功能。在多种毒物诱导的肝损伤动物模型中,ALR可促进肝细胞再生,减轻急性肝损伤,改善肝功能,增加动物存活时间和提高动物存活率。近来,研究发现ALR能够抑制T细胞、NK细胞等多种免疫细胞的增殖和激活,具有免疫调节作用。由于重组ALR蛋白的稳定性差、生物利用度低等原因,体内研究较少,其发挥免疫调节的作用机制尚不明确。基因治疗的方法弥补了重组蛋白的不足。本文通过基因治疗的方法研究ALR对刀豆蛋白A (Concanavalin A, Con A)诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用,对ALR的免疫调节功能进行了研究。本实验室先前已经成功的构建hALR重组质粒与微环,并应用于肝纤维化治疗研究。本研究在此基础上,大量的制备了hALR的重组微环。ALR重组微环通过水动力转染,显著地提高小鼠肝脏内ALR的表达。在30 mg/kg Con A诱导的重度免疫性肝损伤动物模型中,经过ALR微环转染后小鼠的存活时间与存活率相比Con A造模组有显著增加。在15mg/kg Con A诱导的轻度免疫性肝损伤动物模型中,ALR组小鼠血清的谷丙转氨酶与谷草转氨酶相比Con A造模组有显著的降低。与Con A造模组相比,ALR组中血清的TNF-a和IL-6蛋白水平有显著的降低,但IFN-γ没有明显变化。上述实验结果表明ALR在肝脏中表达的增加可以减轻Con A诱发的免疫性肝损伤,对免疫性肝损伤的小鼠具有保护作用。因此,我们对ALR的免疫调节机制做进一步研究。通过荧光实时定量PCR检测,ALR组小鼠肝脏内的炎性因子TNF-a mRNA和IL-6 mRNA显著的低于ConA造模组,IFN-γ mRNA则没有显著差异。该结果与先前的血清蛋白检测结果一致,证实ALR在Con A诱导的肝炎中可以降低TNF-α和IL-6的表达,但不能抑制IFN-γ。随后又对肝脏中iNOS mRNA、趋化因子CXCL-10 mRNA和CCL-3 mRNA进行检查,相比Con A造模组,ALR能够降低iNOS、趋化因子CXCL-10和CCL-3的表达。流式细胞术检测结果显示ALR组小鼠肝脏内淋巴细胞的比例、CD4和CD8 T细胞的阳性率显著的低于Con A造模组。该结果说明ALR抑制了T淋巴细胞在肝组织中的浸润与激活。此外,Western免疫印迹结果显示,ALR组小鼠肝脏中NF-xB p65和 IxBa蛋白磷酸化的比例显著低于Con A造模组,说明ALR抑制了NF-xB信号通路活化。相比Con A造模组,ALR组小鼠肝脏中磷酸化的JNK和p38-MAPK也有显著的下调,说明ALR对JNK与MAPK信号通路也存在抑制作用。以上结果表明ALR通过抑制炎性细胞因子、趋化因子、T淋巴细胞和多条信号通路减轻了Con A诱导的免疫性肝损伤,证实ALR具有免疫调节作用。


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