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绿茶化学成分的动态变化和抗氧化活性研究

付春旺  
【摘要】:茶叶为山茶科山茶属植物-茶Camellia sinensis(L.) O.Ktze的干燥嫩叶或叶芽,已成为仅次于水的世界第二大饮品。本研究以两个产区的不同采收季节绿茶为研究对象,对其中的化学成分、抗氧化活性的动态变化,相关成分的药动学以及抗氧化的机理,进行了研究。研究内容如下:绿茶中化学成分的质谱鉴定和儿茶素类成分的质谱裂解规律研究利用UFLC/MS-IT-TOF高分辨质谱,并结合Formula predictor分子式预测软件,对绿茶中的主要化学成分进行鉴定和解析。共鉴定出18个化合物,包括生物碱2个:可可碱和咖啡因;氨基酸1个:茶氨酸;儿茶素类10个:分别为表没食子儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素3-甲基没食子酸酯和表没食子儿茶素-3,5-双没食子酸酯;原花青素类1个:原花青素二聚体B2;酚酸类3个:没食子酸、5-没食子酸酰奎宁酸、1-没食子酸酰葡萄糖;黄酮类1个:芦丁。并且对EGC/GC,ECG/CG, EC/C,EGCG/GCG四对对映体进行了质谱裂解规律解析。初步阐明了绿茶的主要化学物质基础,为其药效物质基础和质量控制方法的深入研究奠定基础。绿茶抗氧化活性的动态变化研究建立了 4种测定不同采收期绿茶抗氧化活性的方法,分别为Folin-Ciocalteu,DPPH,ABTS,FRAP,并分别将其应用于绿茶样品的测定。实验结果表明,狮峰龙井和梅家坞龙井绿茶的多酚含量和抗氧化能力,呈现先升高后降低的趋势。分别以6, 7月份含量最高,抗氧化能力最强;并均以9月份含量最低,抗氧化能力最差。多酚含量和抗氧化能力与采收期的变化相同,进一步证明了多酚含量与抗氧化能力的正相关性,且多酚类物质是绿茶发挥抗氧化作用的主要成分。绿茶不同采收期化学成分动态变化研究建立了同时测定绿茶中氨基酸、生物碱和多酚类成分的UFLC/MS-IT-TOF分析方法。采用Gemini C18色谱柱(250 mm×4.6 mm id, 5 μm),以0.1 %甲酸乙腈-0.1 %甲酸水进行梯度洗脱,离子源为ESI源,正负离子同时扫描方式,选择离子监测。所测13种化合物在考察的范围内与峰面积呈良好的线性关系(r≥0.9991,n = 5),各成分的平均回收率在93.9 % ~107.3 %之间,RSD均小于5.5 %。经过方法学验证,该方法灵敏、具有较好的准确度、重复性和精密度,适用于绿茶样品中13种成分的同时含量测定。测定结果表明,不同产区对绿茶化学成分的影响较小,13个化学成分含量的变化规律基本一致。绿茶的采收季节则对其成分的动态变化影响显著,且化学成分随采收季节的变化不尽相同:其中,咖啡因、表儿茶素、儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯呈现总体随采收期先升高后降低的变化趋势;茶氨酸、可可碱、没食子酸、芦丁、表儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯呈逐渐下降的趋势;总的生物碱和总的绿茶多酚呈现先升高后降低的趋势。EGC, EC, EGCG,ECG的大鼠体内药动学研究采用尾静脉注射法,研究了大鼠静脉给予EGC,EC,EGCG,ECG的血浆药动学行为。以原儿茶酸为内标,血浆经乙酸乙酯萃取后取上清液,吹干,流动相复溶后进样分析。EGC,EC, EGCG,ECG分别在2.1 ~839 ng·mL-1,3.3 ~1324 ng·mL-1,8.7 ~3460 ng·mL-1和11 ~4388 ng·mL-1范围内线性关系良好,待测物和内标的提取回收率均大于75.0 %,方法的专属性、基质效应、精密度、准确度和稳定性均符合生物样品分析要求。大鼠静脉注射给药后,EGC,EC, EGCG,ECG的峰浓度Cmax分别为582.2 ±83.8, 617.1 ±117.8, 2659±427.8, 1201 ± 234.2ng·mL-1;曲线下面积AUC(0-∞)分别为 1.016×104±9.60×102,2.397×104± 1.736× 104,5.783×104±2.690×104,4.369×104± 1.715×104μg·min-L-1;半衰期t1/2分别为25.9 ±5.5,26.7 ±3.91,38.6 ±11.3, 32.8 ±12.5 min,即EGC消除最快,EC次之,EGCG最慢。四种儿茶素类成分在大鼠体内消除迅速,给药6 h后,药物在体内基本消除。ECG与其它三个成分相比,给药量最少,而其Cmax要高于EGC和EC,表明其吸收好。绿茶对衰老模型大鼠的正向干预作用研究通过给予大鼠长期注射D-半乳糖造成大鼠整体的衰老状态,并通过Morris水迷宫法行为学实验、脑组织生化指标测定实验以及大鼠海马区组织切片的变化等验证模型复制成功。低、中、高各剂量组绿茶,对D-半乳糖诱发的衰老起到了延缓作用,并以高剂量组(400mg/(kg/day))最为显著。衰老大鼠模型的复制成功以及绿茶对衰老大鼠的正向干预作用,为利用代谢组学技术阐述绿茶的抗衰老作用和机制奠定了基础。绿茶抗衰老机理的代谢组学研究本研究利用UFLC/MS-IT-TOF和Profiling solution代谢组学软件,对空白组、D-半乳糖致衰老模型组和绿茶给药组大鼠的血清、脑组织以及尿液代谢轮廓谱进行PCA分析,发现大鼠腹腔注射D-半乳糖和灌胃给药绿茶后大鼠的血清、脑组织以及尿液的代谢物组都发生了明显的变化。根据Score图发现,模型组远离空白对照组,而绿茶给药组具有向空白组靠近的趋势。正负离子模式下的Score图进一步证明D-半乳糖致衰老大鼠模型的成功和绿茶对D-半乳糖致衰老大鼠抗氧化的正向干预作用。根据Loading图结果,筛选出对Score图分型贡献较大的生物标记物,通过质谱鉴定和结构解析。在大鼠血清代谢组中筛选出12种生物标记物,分别为溶血磷脂胆碱类成分LPC (16:0),LPC (18:2),LPC (18:0),LPC (20:5),LPC (20:4),LPC (22:6),鞘脂类成分C16DHS,C18DHS,C20DHS, C18PHS,C20PHS,氨基酸:色氨酸;大鼠脑组织代谢组中筛选出10种生物标记物,分别为乳酸、半胱氨酸、牛磺酸、肌酸、腺苷和鞘脂类成分C16DHS,C18DHS,C20DHS,C18PHS,C20PHS;大鼠尿液代谢组中筛选出6种生物标记物,分别为肌酐、肌酸、色氨酸、苯丙氨酸、马尿酸和苯乙酰甘氨酸。并从生物学角度,利用各生物标记物在大鼠体内的动态变化,阐明了绿茶的抗氧化活性。


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