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阿维菌素生物合成基因改造的研究

陈红霞  
【摘要】: 本文以阿维菌素产生菌Streptomyces avermitilis为研究对象,利用基因工程方法,将出发菌株Streptomyces avermitilis S-2基因组DNA上的阿维菌素生物合成基因簇进行了基因改造。将该基因簇中的aveD基因通过插入外源的安普霉素抗性基因片段使其失活,导致发酵产物中4个A组分(不需要的组分)的消失;将基因簇中的aveC基因通过同样手段,使其失活,导致发酵产物中4个“1”组分的消失,而主要积累“2”组分(进一步改造可成为伊维菌素的前体B_2组分)。 为了得到aveD基因片段,首先根据已知的阿维菌素生物合成基因簇的核苷酸序列,设计并合成了由18和20个核苷酸组成的5′端和3′端引物;以Streptomyces avermitilis S-2基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了2.2kb的含有aveD基因的DNA片段。将1.5kb的安普霉素抗性基因片段插入到aveD基因中的NruI酶切位点,再将此灭活的aveD基因片段插入到具有接合转移功能(含有oriT基因)的链霉菌—大肠杆菌穿梭质粒pHJL401的多克隆位点区,由此得到重组质粒pID03。 以含有aveC基因的3.1kb基因组DNA PstI片段为基础,将1.5kb的安普霉素抗性基因片段插入到aveC基因中的Sph I酶切位点,再将此插入失活的aveC基因片段连接到具有接合转移功能(含有oriT基因)的链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒pHJL401的多克隆位点区,由此得到重组质粒pC05。 沈阳药科大学硕士学位论文 中文摘要 一 将质粒pID03,pC05分别转化大肠杆菌ET12567,得到的 转化子经扩大培养后,利用接合转移的方法分别将质粒转入到 阿维链霉菌S-2(Streptomyces avermitilis S-2)细胞内。经过 在MYM平板上的传代和抗性标记的筛选分别得到了同源双交 换的菌株Av e D 2 4和AveCg。 分别提取同源双交换茵株Av e D 2 4和Av e C 9基因组DNA, 通过萨瑟恩(Southern)DNA印迹杂交,结果证明 l.skb的安 普霉素抗性基因分别插入到了基因组DNA的3.4kb(含有aveD 基因)BamH片段,和 3.okb(含有 aveC基因)Notl片段中。 对菌株Av eD24发酵产物的HPLC分析表明,菌株正象预 期的那样不再产生A组分,而只产生B组分。此外,该菌株 还产生两个异常的组分D24和D242,经HPLC及质谱进一步 分析,初步确定异常组分D241 为寡霉素A,而D24-2为5. 酮阿维菌素la。 对菌株AveCg发酵产物的HPLC分析表明,菌株AveCg 正如预料的一样不能生物合成四种“ 1” 组分,而只能合成四 种“ 2” 组分。


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