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人参皂苷-Re对帕金森病模型小鼠脑内多巴胺能神经元保护作用机制的研究

徐琲琲  
【摘要】: 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种多发于中老年人的慢性神经系统退行性疾病,其特征性病理改变为黑质致密部多巴胺能神经元(dopamincrgic neuron)变性、坏死,继而引起纹状体多巴胺(Dopamine,DA)含量降低。由于PD病因及发病机制目前还不完全清楚,一般认为,氧化应激、细胞凋亡和线粒体功能障碍等多种因素增加了PD的易感性。因此,对神经元的保护和抗细胞凋亡等方面的治疗已成为现在PD治疗的主要思路。其中中药治疗在提高PD治疗效果、减少副作用和控制PD的一些非运动障碍症状等方面取得了一定的疗效。 人参皂苷-Re(ginsenoside-Re,以下简称Re),为名贵中药人参的有效成分之一,其生物活性广泛。Re与人参皂苷-Rbl、-Rb3、-Rg1等均有不同程度抗氧化和清除自由基的作用,在前期的研究工作中我们也发现Re可通过调节脑内单胺类递质的合成与代谢而达到抗氧化应激的作用。故推测Re可能具有治疗PD的作用。 本研究以C_(57)BL/6小鼠为研究对象,用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyddine,MPTP)制备PD小鼠模型,分别用行为学、高效液相色谱.电化学检测法(High performance liquid chromatography-electrochemical detection,HPLC-ECD)、逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)、免疫组织化学染色法、原位杂交法(In situ hybridization histochemistry,ISHH)、DNA断裂点标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling,TUNEL)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)以及透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)等技术和方法观察Re预处理对MPTP诱致PD小鼠的黑质致密部(substantia nigra pars compacta, 沈阳药科大学博士学位论文摘要 sNc) DA能神经元是否有保护作用,并进一步探讨其可能的脑内细胞分子生物 学机制。主要结果如下: 1.人参皂昔一Re对帕金森病小鼠多巴胺神经元的保护作用 通过爬杆、悬吊和游泳三项行为学实验结果显示,模型组小鼠均出现不同程 度的行为障碍,得分较生理盐水对照组明显降低;而Re预防给药组小鼠得分则 未见明显降低,以Re预防给药高、中剂量尤为显著。提示Re对模型小鼠的运 动协调能力有明显的改善作用。 模型组小鼠纹状体DA含量下降84%,高香草酸(homovanillie aeid,HVA) 含量下降65%,HV阳DA比值增高。而Re预防给药组小鼠纹状体内DA和HVA 含里明显恢复,HV阳DA比值降低;运用免疫组织化学染色法可观察到模型组黑 质致密部酪氨酸轻化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫反应阳性神经元数目与 生理盐水对照组相比明显减少(降至正常的40%左右),Re预防给药组TH免疫 反应阳性神经元明显高于模型组,故可以判定此MP仰致小鼠PD模型造模成功, 并揭示Re具有保护黑质多巴胺神经元的作用。 胶质原纤维酸性蛋白(glia fabrill卿aeidie nrote恤,GEAP)免疫组化结果显 示:与生理盐水对照组相比,模型组小鼠中脑黑质部可见GFAP免疫反应阳性星 形胶质细胞增生(P0 .01);而高、中剂量Re预防给药组与模型组比较未见明显 的GEAP免疫阳性星形胶质细胞的增生(P0 .01)。结果表明DA神经元损伤程 度明显减轻与Re具有防止黑质致密部瘫痕化胶质细胞增生有关。 本研究证实,与生理盐水对照组相比,模型组PD小鼠的纹状体(CPu)和 黑质网状带(SNr)丫一氨基丁酸(Y一姗访。b试州c acid,GABA)免疫反应阳性 神经元数目明显减少(P0.01),而Re预防给药组小鼠CPu和sNr区未见GABA 免疫反应神经元数目减少。结果提示,Re通过增加PD小鼠黑质网状带GABA 能神经元的表达,以保证两个通路的兴奋一抑制平衡。我们推测Re可能是通过促 进CPu和SNr内的GABA能神经元的表达,从而抑制SNr的过度兴奋,调节基 底节神经回路的兴奋抑制平衡而发挥其抗PD作用的。 2.人参皂昔一Re对帕金森病小鼠中脑黑质多巴胺神经元凋亡的保护作用 透射电镜检查是目前鉴定细胞凋亡最具特征性的手段,TUNEL检测法是细 沈阳药科大学博士学位论文摘要 胞凋亡最敏感的方法之一。本实验结果发现,凋亡的黑质多巴胺神经元细胞缩小, 细胞核体积缩小,细胞膜完整,染色质固缩聚集于核膜形成一个或数个沿核膜分 布的块状小体或新月型小体。经一定剂量的Re预处理后,存活神经元数目增多, 多巴胺能神经元脱失现象减少,凋亡细胞比例也随之下降。以上的研究结果提示, Re对MP仰诱致黑质神经元凋亡有阻断作用,并且此作用与Re的剂量呈一定的 量效关系。 P53免疫组化结果发现:与生理盐水对照组相比,模型组小鼠黑质P53蛋白 表达显著增多(P0.05),而Re预防给药组小鼠黑质P53蛋白表达与模型组相比 显著减少(尸切,05)。结果提示,Re的抗黑质DA能神经元凋亡的作用机制可能 与减少P53蛋白表达有关。 本研究观察到模型组MP仰可诱导黑质致密带Bax蛋白和bax mRNA表达 水平增加,而Bcl一2蛋白和bd一2 mRNA表达水平降低,与生理盐水对照组相比 差别显著(尸0.01);同时Re预防给药组与模型组比较,小鼠黑质致密带Bcl一2 蛋白和bd一2 mRNA表达水平均


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