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中草药活性成分DRG和HS-2抗癌活性的细胞分子生物学研究

王三龙  
【摘要】: 本论文以寻找天然抗癌活性化合物并探讨其抗癌作用机理为主要方向。首先采用四甲基偶氮唑盐即MTT法,利用人慢性骨髓性白血病K562(human erythroleukemia)和人大肠癌HCT-15(human colon carcinoma)两种细胞系,对128种抗癌中草药单体成分进行了体外抗细胞增殖活性的初步筛选。结果发现,在所选用的四种浓度下(100、50、25、12.5μg/ml)对K562细胞增殖均有明显抑制作用的样品有6种:DRG、HS-2、S11、S23、S31、S37;对HCT-15细胞增殖均有明显抑制作用的样品有7种:DRG、HS-2、S11、S23、S31、YIA5、YIA59。其中DRG和HS-2在100、50、25 μg/ml时,主要表现为细胞毒作用,而在12.5μg/ml时,显示有细胞毒和细胞凋亡作用。文献检索发现DRG和HS-2均为已知化合物,但DRG的抗癌活性为本研究首次发现。我们运用多种方法对这两个化合物分别进行了细胞凋亡诱导方面的研究,并首次对它们诱导细胞凋亡的机制做了详细的探讨。 一.DRG抗癌活性研究及作用机制探讨 通过MTT法研究了DRG对五种人癌细胞系:人卵巢癌A2780(human ovarian adenocarcinoma)细胞系、人表皮细胞癌A431(human epidermoid carcinoma)细胞系、人肺癌A549(human lung adenocarcinoma)细胞系、HCT-15细胞系和K562细胞系的增殖抑制影响,其半数有效浓度(IC_(50))分别为9.33±0.22 μM、18.7±0.16μM、9.98±0.38μM、5.86μ0.14μM、6.44±0.10μM,IC_(50)值明显低于阳性对照顺铂(cisplatin,CDDP)。 分别应用光学倒置显微镜、荧光显微镜及电子透射显微镜观察凋亡细胞形态变化、库尔特全自动颗粒粒度分析仪(Coulter Multisizer Ⅱ)分析凋亡小体体积分布、DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯状带的形成、流式细胞术(FCM)检测Sub-G_0/G_1峰凋亡百分率、Annexin V-FITC检测磷脂酰丝氨酸(PS)的外翻及FCM检测线粒体跨膜电位(Δψm)等方法从不同角度研究了DRG诱发细胞凋亡的效应;进一步应用Western blotting分析相关蛋白表达和剪切、用荧光分光光度计检测DRG 沈阳药科大学博士学位论文 中英文摘要 与Bel一2同源结构域3(BH3)竞争结合Bel一XL蛋白实验及反转录PCR(RT一PCR) 分析DRG对Bd一2、Bax mRNA转录水平的影响等实验来对DRG诱导细胞凋亡 的机制进行了研究。 实验结果表明,DRG能够以浓度和时间依赖的形式显著抑制HCT一15和K562 细胞的增殖。通过显微镜观察、Coulter Multisizer 11分析、DNA梯带检测、FCM 分析及PS外翻等方法,在两种细胞系中都检测到细胞凋亡时所具有的典型形态 学变化和生化学特征,从不同角度证明DRG确实通过诱导HCT一巧和K562细胞 发生凋亡而发挥肿瘤细胞增殖抑制作用。对线粒体膜电位的研究发现,经不同浓 度的DRG作用24h及10林M DRo处理HCT一15细胞不同时间后,均导致HeT一15 细胞线粒体△平m以量效和时效依赖的形式下降;进一步利用Western blotting方法 检测与死亡受体及线粒体途径相关的一些蛋白的表达情况表明,随着DRG作用 时间的延长,Cyt。。呈时效性地从线粒体释放到胞质中,同时Bax与Bcl一2蛋白 表达的比例呈增高趋势,Caspase一9酶原、CasPase一3酶原和PARP等被剪切成具 有活性的片段,但是Caspase一7酶原却未见剪切,同时还不影响P53和Bcl一xL的 表达,说明DRG通过促发线粒体调控的细胞凋亡途径来诱导HCT一巧细胞凋亡。 另外,DRG也不抑制BH3短肤与Bcl一XL的结合。反转录PCR检测结果表明,DRG 诱导了凋亡相关基因Bcl一2和Bax的mRNA转录表达的变化,它们的变化导致 Bcl一2蛋白表达水平的下降和Bax蛋白表达水平的升高,而过量的Bax通过彼此间 形成同源二聚体来进一步诱发凋亡,揭示出Bcl一2和Bax基因参与了DRG诱发的 HCT一15细胞凋亡。 总之,DRG诱发HCT一15细胞凋亡的分子机制在于从基因水平影响Bax和 Bcl一2靶基因的转录表达,进而上调二者的蛋白表达比例,并最终通过激活经典 的线粒体途径来发挥其HCT一巧细胞凋亡诱导作用。 二.HS一2抗癌活性研究及作用机制探讨 通过MTT法研究了HS一2对A2780、A431、A549、HCT一15和K562五种细 胞系的增殖抑制影响,半数有效浓度(ICso)分别为55.55士0.32拼M、17.22土0.22 林M、50.00士0.17协M、26.35士0.11林M、56.09士0.23林M。 分别应用多种方法研究了 HS一2作用于K562和HCT一巧细胞系所诱导的细胞 凋亡,并应用Westem blotting、体外Bcl一XL蛋白检测实验及RT一PcR对Hs一2诱 导细胞凋亡的机制进行了研究。 沈阳药科大学博士学位论文 中英文摘要 实验结果表明,HS一2明显以浓度和时间依赖的形式抑制HCT一巧和K562细 胞的增殖。通过显微镜观察、Coulter Multisizer 11分析、DNA梯带、FCM检测 Sub一GO/GI峰凋亡百分率及PS外翻等方法,在两种细胞系中都检测到细胞凋亡时 所具有的典型形态学变化和生化学特征,从不同角度均证明HS一2确实通过诱导 HCT一巧和K562细胞发生凋亡而发挥肿瘤细胞增殖抑制作用;对线粒体膜电位的 研究发现,经不同浓度的HS一2作用24h及50林M HS一2处理HCT一巧细胞不同时 间后,导致HCT一巧细胞线粒体△平m急剧下降;进一步利用Westem b


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