氯胺酮在人肝微粒体CYP450系统中的代谢

【摘要】： 本试验采用中国成人肝组织，通过差速离心法制备了肝脏微粒体，建立人肝微粒体体外温孵和NADPH再生体系，对氯胺酮进行体外代谢，研究其酶促反应动力学特征，测定药物体外代谢酶促反应动力学参数Vmax和Km来预测药物的体内代谢清除率，并分析不同人对氯胺酮代谢的差异。 由氯胺酮的体外酶促反应动力学特征可知，氯胺酮的N-去甲基反应显示出二相酶促动力学特征，结果显示，至少有二种酶系统对氯胺酮的N-去甲基代谢有作用。据Michaelis-Menten方程和Eadie-Hofstee制图法求得氯胺酮代谢为N-去甲基氯胺酮的酶动力学参数最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为5.44pmol／min／pmol P450，45.7μmol／L；12.01pmol／min／pmol P450，1875.3μmol／L，Vmax／Km值分别为119×10~(-6)ml／min／pmol P450，6.4×10~(-6)ml／min／pmol P450，得到体外总清除率(Cli)为26.2×10~(-6)ml／min／pmol P450，N-去甲基氯胺酮途径的清除率为20.1×10~(-6)ml／min／pmol P450，由此可知，氯胺酮氧化代谢后，80％生成N-去甲基氯胺酮。氯胺酮的N-去甲基代谢为主要的代谢途径。 根据10名损献者氯胺酮体外代谢氯胺酮的清除半衰期，经对数转换后进行方差分析，并进一步用双单侧t检验分析。结果表明，10名损献者对氯胺酮的代谢存在显著差异。 本试验应用CYP2C9的特异性抑制剂磺胺苯吡唑(1μM，10μM，100μM)检测人肝微粒体对氯胺酮的代谢的抑制性。结果表明在高浓度(100μmol／L)时可对氯胺酮N-去甲基代谢的抑制率达57.6％。同时又用CYP2C9的特异性底物甲苯磺丁脲(10μM)与氯胺酮共孵育，HPLC测定的结果为，氯胺酮的剩余浓度只比未加入甲苯磺丁脲时下降了15.8％，这也间接地说明了磺胺苯吡唑可能也为CYP286的抑制剂。CYP286可能是CYP450系统中代谢氯胺酮的主要酶，而CYP2C9在氯胺酮的代谢中的作用较小。 建立了反相高效液相色谱法(HPLC)测定氯胺酮及其主要代谢产物—N-去甲基氯胺酮的浓度的方法，利用乙腈沉淀肝微粒体中的蛋白后，采用Hypersil ODS2色谱柱(5μm，150mm×4.6mm)，0.025mol／L KH_2PO_4-乙腈-三乙胺(54：46：0.02)作流动相，以1ml／min的流速洗脱，以布比卡因为内标定量氯胺酮及其代谢产物的浓度。本方法能满足氯胺酮浓度测定的需要，灵敏度高、简便、快速、可靠，方法的日内、日间精密度(RSD)均小于10％。