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天然抗氧化物拮抗胰岛素抵抗的分子靶点筛选

郑锦花  
【摘要】:糖尿病分子发病机理的进展涉及了近百种基因的转录与翻译水平表达及其生物学作用的异常,尤其值得注意的是氧化侵袭作为糖尿病及其合并症发生发展的核心机制一直是近年来糖尿病研究领域关注的前沿问题之一。糖尿病是由遗传因素与环境因素共同作用引起的慢性退行性疾病,从胰岛β细胞受损至糖尿病发作经过较长时间的潜临床状态。针对糖尿病发病的核心机制筛查抗氧化胰岛β细胞保护作用分子靶标,在糖尿病原始病因不清、发病率攀升不降的条件下可能对糖尿病的分子水平防治起关键作用。 2型糖尿病占糖尿病的绝大多数,胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要环节。越来越多的资料证明,氧化应激产生的ROS作为一种信号分子一方面能激活胰岛β细胞内一系列应激信号通路,使胰岛β细胞发生氧化应激反应,从而导致胰岛β细胞损伤,胰岛素分泌减少;另一方面能损伤胰岛素信号转导通路,导致胰岛素抵抗。氧化应激引起的胰岛素抵抗信号转导通路:(1)氧化应激激活JNK、PKC和IKK,均可通过增加IRS307丝氨酸磷酸化,抑制该位点正常的酪氨酸磷酸化,导致胰岛素传导受阻;(2)IRS1的酪氨酸磷酸化被抑制后,PI3K-AKT通路受阻,胰岛素分泌减少,同时使胰岛素刺激的GLUT2从胞浆向胞膜转位减少,导致胰岛素抵抗。(3)氧化应激激活IKK,使NFκB获得活性进入胞核后,加重胰岛素抵抗,引起细胞凋亡。 天然抗氧化物(NA)主要是指在体内具有清除自由基,防止氧化侵袭的多种微量元素、维生素和食物中的其它抗氧化物质。研究表明,NA对拮抗氧化侵袭、防治糖尿病有重要的作用。近年来有关NA抗氧化侵袭及防治糖尿病的研究取得了进展,已筛选出多种NA,如Se、VE、VC、硫辛酸、烟酰胺、大豆异黄酮等。目前认为其抗糖尿病机制有:(1)类胰岛素样作用或促进胰岛素释放;(2)清除自由基,抑制脂质过氧化,预防胰岛β细胞氧化损伤;(3)提高胰岛素的敏感性;(4)减少DNA损害或促进DNA修复,主要有烟酰胺和大豆异黄酮等,烟酰胺可以直接补充体内NAD池,促进DNA修复,可保证三羧酸循环的正常进行,从而避免细胞死亡;大豆异黄酮有保护DNA免受氧化攻击的作用。 目前国内外对天然抗氧化物胰岛β细胞保护作用以及拮抗胰岛素抵抗分子作用靶点尚不明确。本研究经过文献循证及课题长期研究的积累,优选出五种天然抗氧化物,即硒、维生素E、硫辛酸、烟酰胺和大豆异黄酮,重点观察其拮抗胰岛素抵抗作用的分子靶点、作用特点、生物学效应及分子机制。通过观察胰岛素抵抗信号转导通路相关转录因子和基因的转录与翻译水平的表达,阐述NA拮抗胰岛素抵抗的分子机制,提出其作用的分子靶点,本研究分三部分。第一部分,进行大鼠胰岛β细胞株(INS1)氧化应激模型的改良研究和人HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立:用不同浓度H2O2在不同作用时间下诱导大鼠胰岛β细胞氧化应激,用流式细胞术等方法检测细胞增殖,ROS和MDA含量, SOD和GSH-PX活力;在氧化应激模型基础上,对硒、维生素E、硫辛酸、烟酰胺和大豆异黄酮的剂量和作用时间优化研究;通过转染人抵抗素基因(pcDNA3.1-human resistin)的HepG2细胞制备胰岛素抵抗肝细胞模型,是用以观察NA拮抗胰岛素抵抗分子机理的高水平细胞模型。第二部分,NA对氧化应激胰岛β细胞的细胞周期和凋亡影响的研究:用流式细胞术检测大鼠胰岛β细胞的细胞周期,观察其凋亡,用以说明NA是否有抗氧化胰岛β细胞保护作用,直接拮抗糖尿病关键中间环节即胰岛素相对或绝对不足。第三部分,NA对胰岛素抵抗信号转导通路相关基因表达的影响:用半定量RT-PCR方法、实时定量PCR方法检测大鼠胰岛β细胞FOXO1、PDX1、MafA、insulin2、IRS1、GLUT2和AKT2基因的mRNA表达;用实时定量PCR方法检测人HepG2细胞JNK1、IRS1、PKC、PI3K、GLUT2基因的mRNA表达;用免疫细胞化学染色方法和Westernblot方法检测大鼠胰岛β细胞FOXO1、PDX1、NFκB、insulin2、IRS1、JNK1和AKT2基因的蛋白表达;用免疫细胞化学染色方法和Westernblot方法检测人HepG2细胞IRS1和JNK1基因的蛋白表达,阐述五种NA对上述基因表达的作用水平及作用靶点。本研究取得如下结果: 1.成功地进行INS1细胞株氧化应激模型的改良及NA添加剂量与作用时间的优化研究。本研究证实了加入H2O2剂量为500μmol/L,作用时间为3h是诱导INS1细胞最佳氧化应激模型,抗氧化酶活力及自由基水平检测等方法均是提示该细胞模型成功的标志。在该氧化应激模型基础上,对联合应用抗氧化物的剂量和时间进行优化研究,筛选出0.1mg/L亚硒酸钠、5mg/L维生素E、10mg/L硫辛酸、122mg/L烟酰胺和0.432mg/L大豆异黄酮为NA的最佳剂量,作用时间为24h,可明显提高抗氧化生物学标志物,降低自由基生成。 2.成功构建了pcDNA3.1-human resistin转染的HepG2细胞制备胰岛素抵抗模型。为了进一步证实NA对胰岛素抵抗信号转导通路的拮抗作用,我们根据国内外最近研究进展,应用重组基因工程技术,构建了pcDNA3.1-human resistin真核表达载体,脂质体介导转入HepG2细胞,率先建立了基于resistin基因转染的胰岛素抵抗细胞模型,葡萄糖摄取实验及糖原染色实验均证明该胰岛素抵抗细胞模型的成功,该模型为进一步研究NA对外周组织胰岛素抵抗的拮抗作用机制提供了先进的细胞模型。 3.国内外率先在pcDNA3.1-human resistin转染的胰岛素抵抗细胞模型上,证实了NA可以拮抗resistin基因转染导致的胰岛素抵抗。其表现特点为,转染resistin的HepG2细胞葡萄糖摄取率明显降低,糖原合成显著下降;而添加不同种类的NA,可明显提高转染resistin的HepG2细胞的葡萄糖摄取率及糖原合成,显著逆转了resistin引起的胰岛素抵抗效应,由于resistin与胰岛素抵抗是新近关注的糖尿病研究领域热点问题之一,而且resistin引起胰岛素抵抗的主要环节通过胰岛素受体起作用,我们的结果首次证实了NA可能通过拮抗resistin作用的关键环节发挥作用,为提出NA拮抗胰岛素抵抗的关键靶点提供实验依据。 4.证实了NA具有抗胰岛β细胞凋亡,促进胰岛β细胞增殖的保护作用。通过流式细胞术检测细胞周期结果表明,联合应用亚硒酸钠、维生素E、硫辛酸、烟酰胺和大豆异黄酮可使S期细胞显著增多,而G_0/G_1期细胞明显减少;流式细胞术检测细胞凋亡结果表明,联合应用NA可以使早期凋亡、晚期凋亡以及死亡细胞数目明显减少,提示NA有抗氧化胰岛β细胞保护作用,可以拮抗糖尿病关键中间环节。 5.阐述了NA拮抗胰岛素抵抗信号转导通路的多分子靶点。在胰岛β细胞株氧化应激模型的基础上发现NA对胰岛素抵抗信号转导通路的主要转录因子和基因的表达具有调控作用。包括下调FOXO1的mRNA表达,可以上调PDX1、IRS1、insulin2、MafA、GLUT2以及AKT2的mRNA表达;可以下调FOXO1、NFκB和JNK1的蛋白表达,可以上调PDX1、IRS1、insulin2和AKT2的蛋白表达,证实了NA可以调控胰岛β细胞的胰岛素抵抗相关多分子靶点转录水平和翻译水平的表达,初步筛选出NA保护胰岛β细胞和拮抗胰岛素抵抗的分子靶点。 6.进一步在转染人抵抗素基因HepG2细胞上阐述了NA拮抗胰岛素抵抗信号转导通路的多分子靶点。在氧化应激胰岛素抵抗信号转导通路的基础上,研究NA对该通路相关基因表达的影响。结果表明,NA可以下调JNK1和PKC的mRNA表达,可以上调IRS1、GLUT2的mRNA表达;可以下调JNK1的蛋白表达,可以上调IRS1的蛋白表达,进一步证实了NA可以调控外周组织的胰岛素抵抗相关分子靶点转录和翻译水平的表达,初步筛选出NA拮抗外周组织胰岛素抵抗的分子靶点。 本研究通过探讨NA调控胰岛素抵抗信号转导通路相关转录因子和基因的表达以及改善胰岛β细胞胰岛素抵抗并保护胰岛β细胞分子作用机制,初步筛选出胰岛β细胞的FOXO1、NFκB、JNK1、PDX1、IRS1、insulin2、MafA、GLUT2和AKT2基因可能是NA保护胰岛β细胞、拮抗胰岛素抵抗的分子靶点,而在外周组织中NFκB、JNK1、PKC、GLUT2基因可能是NA拮抗胰岛素抵抗的分子靶点,上述靶点的发现为改善胰岛素抵抗以及营养学领域开展糖尿病的Ⅱ级人群预防提出分子靶标。


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