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特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定

高鹏  
【摘要】:利用基因工程操作技术克隆了4个分别含有表达产物为147个氨基酸的酵母转录激活因子核苷酸序列和(或)核定位信号(NLS)和(或)Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)穿膜肽(Tat)的嵌合核苷酸序列,并分别命名为GAL4/147、NLS-GAL4/147、Tat-GAL4/147和Tat-NLS-GAL4/147。将上述核苷酸序列克隆入原核表达载体pET28a(+),分别构建了原核表达质粒pET28-G(含GAL4/147序列)、pET28-NG(含NLS-GAL4/147序列)、pET28-TG(含Tat-GAL4/147序列)和pET28-TNG(含Tat-NLS-GAL4/147序列)。将原核表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并对诱导时间、培养温度、培养转速、IPTG浓度等表达条件进行优化,从获得目的蛋白G (pET28-G表达产物)、NG (pET28-NG表达产物)、TG (pET28-TG表达产物)和]NG (pET28-TNG表达产物)。 结合本课题组构建的含有能够被GAL4识别和结合的半乳糖上游激活序列(UAS)、绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒(pUAS-EGFP),对所表达蛋白在细胞内和细胞外水平的UAS序列特异性结合和转导功能进行了探讨。结果表明,G、NG、TG和TNG均可有效的识别和结合含有UAS序列的质粒DNA;含有Tat片段的TG和TNG能够有效的将携带UAS序列的pUAS-EGFP质粒转导入真核细胞,且实现所转导pUAS-EGFP质粒外源基因(EGFP)的表达。 结合本课题组构建的含有UAS序列、凋亡素基因(Apoptin)的真核表达质粒pUAS-Apoptin和所制备的多结构域嵌合蛋白,在体内、外分别对肝癌细胞HepG-2和C57BL/6小鼠荷肝癌模型进行了抑瘤作用研究。MTT检测、AO/EB检测、DAPI检测、Caspase酶检测、线粒体膜电位检测、细胞活性氧水平检测等细胞水平检测结果和免疫指标、抑瘤率、平均生存期、肿瘤生长趋势等模型动物体内检测结果表明,多结构域嵌合蛋白可以有效的介导pUAS-Apoptin对人肝癌细胞HepG-2和模型动物体内实体肿瘤的抑制。


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