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富血小板血浆对MG63,hADSCs及hDFbs细胞生物学行为影响的实验研究

王悦  
【摘要】:富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)是从全血中提取的血小板含量超过全血4~5倍的血浆,研究表明PRP体外激活后,其中的血小板α颗粒可释放出多种生长因子,参与机体组织修复如减少出血、抗感染、加速软组织愈合、骨组织再生等,故近年来被应用于外科领域包括牙周病、种植义齿及口腔颌面外科等。但是,PRP中各生长因子间作用机制尚不清楚,且一些基础研究、动物实验和临床疗效之间出现相反结果,使PRP的有效性受到质疑,因此限制了其在临床的应用。为此本研究力图通过观察PRP对三种细胞—人成骨样细胞MG63、人脂肪间充质干细胞(hADSCs)、人真皮成纤维细胞(hDFbs)生物学行为的影响及其在兔颅顶骨缺损修复过程中的作用,从细胞水平、基因水平,探讨PRP应用中的一些问题。 在对PRP提取方法的研究中,对三种离心方法进行了比较,采用流式细胞仪检测血小板表面标志因子CD41和活化标志因子CD62p,结果表明,第一次离心,1 600 r/min,10 min,第二次离心,5 000 r/min,5 min的提取方法,使血小板活化率低于PCCSkit法和Curasan法,更有利于保持血小板的稳定性;ELISA检测结果表明,单加CaCl2和CaCl2加凝血酶的激活方法均可促进PRP中血小板衍化生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)的释放且两种方法间各有所长;控温(15~20℃)离心提取的PRP白膜层,较常温离心提取的更均匀;PRP激活后经离心提取的萃取液,较未经离心直接使用的PRP,更有利于镜下细胞形态观察。 实验结果表明,适宜浓度的PRP对MG63的增殖、迁移均有促进作用;扫描电镜及激光共聚焦显微镜显示,加PRP后促进了MG63在材料表面的黏附、伸展及增殖,提高了MG63与纯钛材料及纳米磷酸钙胶原骨材料的生物相容性;实时定量-PCR检测结果表明,适宜浓度的PRP可上调细胞VEGF、I型胶原(COL-1)和骨形态发生蛋白-4(BMP-4)mRNA的表达,但PDGF和VEGF mRNA的表达趋势相反;Western blotting检测结果表明,PRP对MG63的原癌基因c-fos、c-myc、抑癌基因P27的蛋白表达均有促进作用,但对粘着斑蛋白Vinculin的表达则表现为抑制。 适宜浓度的PRP可明显促进hADSCs的增殖;在无成骨诱导条件下,尽管PRP对hADSCs表现出促增殖作用,但对其成骨分化表现为抑制;成骨诱导条件下,PRP促进细胞增殖的同时,还表现为促进hADSCs的成骨分化,并具剂量依赖性;实时定量-PCR检测结果表明,适宜浓度的PRP可上调hADSCs的PDGF、VEGF、COL-1和BMP-4 mRNA的表达。 适宜浓度的PRP可明显促进hDFbs的增殖;在成骨诱导条件下,PRP可促进hDFbs的成骨分化;免疫细胞化学检测表明,虽然PRP促进hDFbs的增殖存在剂量依赖性,但同一浓度的PRP对hDFbs表达PDGF、TGF-β和VEGF的影响不同,PDGF表达量高的组TGF-β1和VEGF表达量低,PDGF表达量低的组TGF-β1和VEGF表达量高;荧光染色观察PRP促进hDFbs在纯钛材料表面生长。RT-PCR检测发现,单独成骨诱导条件下,PDGF mRNA表达上调;有PRP存在的条件下,PDGF mRNA表达下调,VEGF mRNA对PRP的反应主要是上调。 兔颅骨缺损修复实验中, X-射线和组织病理学检测结果表明,与单纯人工骨粉修复的缺损相比,PRP促进了新生骨形成,提高了骨密度,加速了人工骨材料与自体骨的融合。 综上结果,不同种类的细胞、不同成熟状态的细胞对PRP的刺激反应不尽相同。PRP具有统一、协调细胞生物学行为的作用。在创伤愈合过程中PRP的主要作用是促进细胞的大量增殖,为组织修复提供大量的新生细胞,而让这些新生细胞表现出具体功能的刺激因子,应源于幼稚细胞所处的不同组织环境中的细胞通过旁分泌产生的刺激因子,而PRP则协同促进细胞功能的表达。在PRP存在的条件下,即损伤存在的病理条件下,成熟细胞中PDGF与VEGF mRNA是两种表达趋势相反的基因,VEGF的表达上调而PDGF表达下调。这些结果表明,组织、细胞对损失的首要反应是促进血管内皮增生,恢复局部血运,而后才表现出正常生理状态下的生物学功能。体外及体内实验共同证实PRP促进细胞增殖作用是确切的,本研究为进一步探讨PRP的生物学功能奠定了实验基础,提供了支持PRP临床应用的理论依据,为组织工程中干细胞的大量扩增及定向分化提供可行、有效的思路。


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