乳腺癌细胞中ERα和DNA甲基化调控CLDN6表达的作用及其机制

【摘要】：目的:探讨乳腺癌细胞MCF-7中雌激素受体α(estrogen receptor alpha, ERα)和DNA甲基化介导CLDN6表达的作用机制及其对MCF-7细胞转移表型的影响。 方法:采用RT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光法检测ERα激动剂(propyl pyrazole triol,PPT)和雌激素受体(estrogen receptor, ER)阻断剂ICI 182,780(ICI)对CLDN6表达的影响;采用Western blot和甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)法检测乳腺癌组织中CLDN6表达和DNA甲基化状态并分析其相互关系;利用5-aza-dC和TSA作用MCF-7细胞,采用RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光法及MSP法检测乳腺癌细胞中CLDN6表达和DNA甲基化状态,用染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecitation,ChIP)检测CLDN6基因与甲基化CpG位点结合蛋白2(5 methyl-CpG binding protein 2,MeCP2)、乙酰化的组蛋白(acetylated H3,H3Ac;acetylated H4,H4Ac)结合;用核酸酶可及性实验分析CLDN6基因所在区域染色质构象;用RNAi技术分析沉默MeCP2对CLDN6表达的影响;划痕法和Transwell小室分析DNA甲基化下调CLDN6表达对MCF-7迁移和侵袭表型的影响。 结果:PPT能够上调MCF-7细胞CLDN6的表达,ICI能够阻断PPT对CLDN6表达的诱导作用;乳腺癌组织和细胞中CLDN6低表达,并与DNA甲基化有关;5-aza-dC和TSA单独及联合作用MCF-7细胞能够上调CLDN6表达;5-aza-dC作用MCF-7细胞可以抑制MeCP2与CLDN6基因的结合,促进H3Ac和H4Ac与CLDN6基因的结合,TSA可以促进H4Ac与CLDN6基因的结合;5-aza-dC可以使MCF-7细胞中CLDN6基因CpG岛附近染色质结构变疏松;RNAi技术沉默MeCP2对CLDN6表达无明显影响;5-aza-dC可抑制MCF-7细胞的侵袭和迁移能力,沉默5-aza-dC作用组细胞中的CLDN6基因能够增强细胞的迁移和侵袭能力。 结论:ERα可以上调MCF-7细胞中CLDN6表达;乳腺癌组织和细胞中CLDN6表达下调与DNA甲基化有关;DNA甲基化下调CLDN6表达与MeCP2的结合、组蛋白H3和H4脱乙酰化及染色质构象改变有关;DNA甲基化下调CLDN6表达可以促进MCF-7细胞的转移表型。