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小鼠朊蛋白相关蛋白Shadoo的表达、纯化、多克隆抗体的制备及其鉴定

吴松波  
【摘要】:异常朊蛋白作为传染性海绵状脑病的致病因子,其存在两种结构形式:一种是正常形式的PrPc,另一种是致病形式的PrPsc。目前普遍认同的观点是PrPc发生构象改变成为Prpsc,后者引发朊病毒疾病。 Shadoo蛋白是基于生物信息学的发展,通过比较基因组学在基因数据库中发现的与朊蛋白结构相似的一种新的膜蛋白,其基因SPRN (shadow of prion protein)序列从鱼类到哺乳动物都很保守。鉴于目前全球还没有针对Shadoo蛋白的小鼠单克隆抗体,并且只有在获得SPRN基因敲除的小鼠品系(SPRN-/-)后才能够制备出相应的单克隆抗体,费时费力,严重影响实验研究进度。因此,制备出反应性好、特异性强的多克隆抗体是深入开展Shadoo蛋白相关研究的必要条件。 在本试验中,首先针对SPRN基因设计一对特异性引物,以酚/氯仿抽提法提取的小鼠全血基因组DNA为模板,PCR扩增出SPRN基因完整的开放阅读框(ORF),利用引物设计时引入的限制性内切酶(BamHⅠ和HindⅢ)消化SPRN基因PCR产物,将凝胶回收纯化后的SPRN基因片段定向插入到经同步酶切消化的原核表达载体pET-32a(+)中,通过PCR及酶切法鉴定出所需要的阳性克隆。将重组质粒pET-32a-SPRN转化至宿主菌Rosetta-gami(DE3)中,经0.4 mM IPTG30℃诱导过夜后,收集表达的包涵体蛋白。表达的Shadoo蛋白经SDS-PAGE分析,在33Ku有一特异表达条带,经过Western-blot检测,表达的蛋白能够被HIS标签抗体所识别。利用位于目的蛋白N端的6His标签进行亲和层析纯化目的蛋白,纯化后浓度达735ug/ml,并通过谷胱甘肽氧化-还原系统对纯化的包涵体蛋白进行透析复性。将复性后的Shadoo蛋白按0.5 mg/只颈部肌肉及皮下多点注射免疫新西兰白兔,五免免后间接ELISA法测定Shadoo蛋白血清抗体效价为1:12800。利用所获得的Shadoo多克隆抗体对鼠脑内源性Shadoo蛋白及细胞转染表达的外源性Shadoo蛋白经SDS-PAGE及、Western-blot检测表明,在20Ku有特异表达条带。 原核表达获得的Shadoo蛋白具有较强的免疫活性。成功的制备了抗Shadoo蛋白多克隆抗体,并具有较高的效价和特异性。对内源性和外源性Shadoo蛋白的Western-blot检测具有较好的免疫原性。


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