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土壤宏基因组文库筛选除草剂降解基因

路杨  
【摘要】:在众多除草剂中,2,4-二氯苯氧乙酸(简称2,4-D)和草甘膦由于具有高效、低毒和价格低廉等优点已成为世界上应用最广泛的两种除草剂。但这两种除草剂在杀灭杂草的同时也会对其所保护的农作物造成一定的伤害,这就限制了它们的大规模推广与应用。如何克服这两种除草剂对农作物的负作用受到了广泛的关注,对它们的相关研究也成为了国内外的研究热点。为了充分利用2,4-D和草甘膦的除草优势,扩大它们的使用范围,培育抗2,4-D和草甘膦转基因作物被认为是一种很有效的杂草防治对策,越来越受到人们的重视。 人们对2,4-D的作用机理仍不清楚,目前多采用过表达2,4-D降解酶,即2,4-Dα-酮戊二酸双加氧酶(tfdA)使农作物获得2,4-D抗性,但有关该酶的报道少之又少。另一方面,目前商业化种植的抗草甘膦转基因作物普遍采用过表达对草甘膦低敏感的CP4EPSPs,但该机制并不能将植物内吸的草甘膦降解,可能会对作物生长发育及人体健康造成一定的潜在影响。我国在除草剂抗性研究方面还处于起步阶段,具有应用价值的除草剂抗性基因还很匮乏,因此有必要挖掘高效、无残留、对人畜低毒或无毒的2,4-D和草甘膦抗性基因。本研究通过构建氯酚污染土壤微生物宏基因组文库首次获得2,4-D降解相关基因,为最终发现新的2,4-D降解基因tfdA提供了实验依据。通过构建草甘膦污染土壤宏基因组文库发现了3个新的草甘膦降解基因,其编码产物能将草甘膦降解成无毒的化合物,这为草甘膦在植物上的应用提供了一种可选择的无草甘膦残留的全新途径。主要的研究结论如下: 本研究构建的氯酚污染土壤微生物宏基因组文库共含有8000个含有插入片段的重组克隆,平均插入片段长度为4 kb,总库容量为32 Mb。通过检测邻苯二酚1,2-双加氧酶(catechol 1,2-dioxygenase,简称TfdC)活性,从文库中筛选得到了一个阳性克隆。对测序结果进行分析表明其上存在着2个与2,4-D降解相关的基因,分别为2,4-二氯苯酚羟化酶(2,4-dichlorophenol hydroxylase,简称TfdB)基因tfdB-JLU (Genbank登录号:GQ403987)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(catechol 1,2-dioxygenase,简称TfdC)基因tfdC-JLU (Genbank登录号:GQ396266)。这两个基因编码方向一致,相距30 bp,基因上游均没有发现SD序列,说明可能受同一操纵子的调控。tfdB-JLU长为1776 bp,编码一个由591aa组成的蛋白质,该蛋白与来源于Cupriavidus necator JMP134 (pJP4)的TfdBII同源性仅为48%。tfdC-JLU长为939 bp,编码一个由312 aa组成的蛋白,与来自于Comamonas testosteroni S44的儿茶酚2,3-双加氧酶有着59%的同源性。 为了验证tfdB-JLU编码产物TfdB-JLU的功能,对其进行了异源表达与纯化。纯化得到的TfdB-JLU对2,4-DCP的比活性为0.16 U/mg,纯化倍数提高了7.8倍,目的蛋白得率为76%。与已报道的TfdB相比,TfdB-JLU具有很广的底物谱,能够催化羟化多种氯酚类物质,且都有很高的相对催化活性。TfdB-JLU的最适温度为25℃,在35℃以下都具有很好的热稳定性。该酶在pH 7.5时表现出最大的活性。TfdB-JLU能被1mM的Cu2+、Hg2+和Zn2+完全抑制。该酶对2,4-DCP的Km值为5μM,对NADPH Km值为6μM。相对于NADH,该酶更偏好以NADPH作为其外部电子供体。蛋白质模拟发现TfdB-JLU上氨基酸残基Trp222和Thr236可能与底物2,4-DCP的羟基形成两个氢键,长度分别为2.32A和1.97 A。 本研究构建了一个草甘膦污染土壤宏基因组文库,该文库中共有160000个含有插入片段的重组克隆,平均插入片段长度为4.5 kb,总库容量为0.72 Gb。采用草甘膦抗性筛选的方法从构建的文库中发现了2个具有草甘膦抗性的克隆,所含阳性质粒分别命名为pGlp-1和pGlp-2。对pGlp-1中插入片段测序结果分析表明其上含有一个草甘膦氧化还原酶(glyphosate oxidoreductase,简称GOX)的编码基因,命名为goxA (Genbank登录号:GU479462)。该基因长为1296 bp,编码一个由431 aa组成的蛋白质。goxA碱基序列与美国孟山都公司专利报道的gox相差6个碱基,且不含有在gox发现的SphⅠEcoRⅠ, EcoRⅤ和Sac I等限制性内切酶酶切位点。另外,goxA编码产物GOXA与gox编码产物GOX蛋白质氨基酸序列相差2个氨基酸。阳性质粒pGlp-2中插入片段测序结果分析表明其上含有一个甘氨酸氧化酶(glycine oxidase,简称GO)编码基因,命名为goA (Genbank登录号:GU479460)。该基因序列长为1110 bp,编码一个由369 aa组成的蛋白质。蛋白质同源性分析发现goA编码产物GOA与源自Bacillus subtilis strain 168的GO有着88%同源性。根据GOXA保守区域设计了一对简并引物,从土壤总DNA中扩增得到了草甘膦氧化还原酶保守区域序列(goxcr),该序列编码产物与GOXA有着高达77%的同源性。通过重叠延伸PCR的方法构建嵌合的gox基因,即chgox (Genbank登录号:GU479463)。chgox编码产物ChGOX与美国孟山都专利报道的GOX同源性仅为79%,两者相差89 aa。 为了验证GOXA和ChGOX功能,将这两个基因重组到表达载体pET28a上,在E. coli BL21(DE3)中过表达。结果表明构建的嵌合酶ChGOX多以包涵体形式存在,通过共表达分子伴侣质粒的方法可以明显改善重组蛋白ChGOX可溶性表达量。酶底物特异性实验结果显示这两个酶具有相似的催化活性,即对草甘膦和亚氨基二乙酸都表现出较高的氧化活性。为了验证GOA功能,构建了含有goA基因的E. coli BL21(DE3)pLysS工程菌。经过Ni亲和层析和阴离子交换层析两步纯化得到的GOA比活力为0.283 U/mg,纯化倍数提高了31.2倍,目的蛋白得率为88.9%。酶底物特异性测定结果表明GOA能够催化多种草甘膦及glycine底物类似物。GOA的最适温度为50℃,且在50℃以下具有很好的热稳定性。酶的最适pH为8.5,GOA在较宽的pH范围(pH 7.3-10.3)内具有很好的pH稳定性。GOA对草甘膦的亲和性(1/Km)是Pedotti等报道的野生型GO的8倍,且GOA对草甘膦的底物选择性(对草甘膦的kcat/Km与其对甘氨酸的kcat/Km之比)也是后者的5.5倍。分子动力学计算表明,GOA与草甘膦的结合自由能是GO与草甘膦结合自由能的2.36倍。从模拟的GOA/GO与草甘膦复合物三维结构中发现,GOA与草甘膦复合物比GO与草甘膦复合物多了2个氢键且氢键键长更短。 这些基因的发现可以为除草剂抗性机理的研究提供理论基础,也为除草剂抗性作物的研发提供潜在的具有应用价值的基因资源,具有重要的实际意义。


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