基于表面增强拉曼散射(SERS)技术的核酸（脱氧核酶）研究

【摘要】：拉曼光谱作为表征分子振动能级的指纹光谱,在物理学、化学、生物学以及材料科学等领域一直扮演着重要的角色。表面增强拉曼散射(SERS)技术增强了基底与分子间的能量转移,避免了荧光背景的干扰,增大了样品的散射面积,从而增强了样品的信号,使拉曼散射光谱检测的精度产生了飞跃。SERS技术在生物化学、生物物理学和分子生物学等方面都存在着广泛的应用。 在本研究中我们利用DFT(Density Functional Theory密度泛函理论)的方法,通过量化计算对核酸各种碱基的分子内化学键振动进行了模拟,并且对实验获得的各种碱基固体拉曼光谱进行了表征。通过比较理论拉曼光谱振动频率与实验拉曼光谱振动频率的吻合情况,我们发现使用B3LYP/6-311++G(d,p)为参数对碱基的振动进行量化计算相对于以往研究人员使用的B3LYP/6-311G(d,p), B3LYP/6-31++G(d,p)等参数进行的计算更为准确,获得的理论拉曼图谱与实验获得的实验图谱具有更高的一致性,预测的拉曼谱峰的振动频率与实际振动频率的偏差不超过2%。 而后又利用在位制备银胶,Lee-Meise银胶和银膜三种体系对核酸碱基的表面增强拉曼光谱进行了研究,并且根据前人的研究成果对获得的表面增强拉曼光谱进行了表征。其中利用在位制备银胶方法获得核酸碱基的表面增强拉曼光谱是第一次被使用,在研究中我们发现腺嘌呤和鸟嘌呤在在位制备银胶体系下的增强拉曼光谱与其余两种体系下的增强拉曼光谱具有很大的区别,而胞嘧啶,胸腺嘧啶和尿嘧啶在三种体系下则具有很高的相似性。为了对这种现象做出合理的解释,我们根据Richard A.J.O'Hairs等人的研究结果建立了两种银离子-腺嘌呤复合体的模型,根据Jitendra Kumar等人的研究结果建立了一种由3个银离子在N1,N3,N7位点与腺嘌呤结合的复合物模型,利用DFT方法对这三种结构模型分别进行了量化计算。通过比较理论拉曼光谱与实验拉曼光谱,发现其中2个腺嘌呤分子与2个银离子形成的复合体与1个腺嘌呤分子与3个银离子作用的模型分子的拉曼光谱与实验光谱具有很高的相似性,所以可以推断腺嘌呤在在位制备银胶体系下的增强拉曼光谱与其余两种体系下的增强拉曼光谱具有区别的原因是这两种复合体在在位制备银胶中的存在。而且通过嘌呤分子的表面增强拉曼光谱在三种体系下区别较大,而嘧啶分子的区别较小的实验现象,也间接地证明了与嘧啶分子相比,嘌呤分子更易与银离子作用形成复合体。通过比较三种增强拉曼光谱信号的方法,发现利用Lee-Meisel银胶溶液获得的增强效果最佳,所以我们选择通过热学还原的方法制备Lee-Meisel银胶溶液作为后续研究的表面增强基底,并且利用银胶基底对寡链核苷酸进行了SERS的研究工作,对得到的增强拉曼光谱进行了简单的表征,为进一步的核酸(酶)分子研究奠定了基础。 拥有了前期对核酸碱基的表面增强拉曼光谱研究的基础,我们利用表面拉曼光谱技术对核酸分子结构进行了研究。首先,我们根据Phan AT等人研究人体端粒核酸序列形成的G-quadruplex结构的结果,利用表面增强拉曼光谱技术对四种核酸序列形成的G-quadruplex结构进行了研究,在研究中发现在K-存在的条件下,人体端粒序列更容易形成含有较多的反转型loop的G-quadruplex结构,而且形成这种结构更利于银胶体颗粒与鸟嘌呤碱基的结合,从而对于鸟嘌呤碱基的拉曼谱峰的增强作用产生影响。尤其在经过对四种人体端粒核酸序列在Na+和K+的环境下的表面增强拉曼光谱的比较,我们发现1382cm-’处的拉曼峰变化最大,所以我们认为可以利用这个峰作为标志来判定人体端粒序列形成的结构;然后,利用SERS技术结合RNAfold理论预测,园二色谱(CD)、差示扫描量热(DSC)以及放射自显影等手段对我们设计的茎环结构脱氧核酶10-23SLD脱氧核酶进行了研究。通过RNAfold理论预测,园二色谱和表面增强拉曼散射实验的结果证实了10-23 SLD脱氧核酶在10℃、25℃和40℃可以富集到不同的构象,由差示扫描量热实验的结果可知10℃和40℃保存的样品热溶解温度(Tm)分别是45℃和60℃,25℃保存的样品存在两个热溶解温度(Tm)45℃和60℃,而且10℃和25℃下保存的脱氧核酶热熔解时放出的能量更多,可以判断10℃和25℃下的脱氧核酶结构更为复杂,通过体外活性实验和放射自显影技术在近生理条件下比较了三种温度下保存的脱氧核酶的催化活性,结果显示10℃和25℃下保存的脱氧核酶因为复杂的茎环结构所以核酶的活性更低；最后,通过紫外可见光谱、园二色谱(CD)、差示扫描量热(DSC)、表面增强拉曼散射光谱(SERS)等技术手段研究了TMPyP4卟啉分子与10-23 HQD之间的相互作用,通过放射自显影技术分析了10-23HQD在不同的卟啉配比下的体外切割实验结果。紫外可见光谱的结果表明卟啉分子与脱氧核酶茎部的G-quadruplex结构之间发生的是插入作用；表面增强拉曼光谱的研究结果表明卟啉分子完全插入到G-quadruplex结构当中,而且卟啉分子与脱氧核酶之间相互作用的位点很可能是卟啉分子吡咯环中的Cm原子；园二色谱和差示扫描量热实验的结果表明随着卟啉分子相对与脱氧核酶分子比例的提高,脱氧核酶的G-quadruplexe结构由混合结构逐渐向反平行G-quadruplexe结构转变,核酶的热稳定性得到了大幅地提高；最后通过体外切割实验证明随着卟啉分子与脱氧核酶分子的作用,脱氧核酶稳定性的提高,脱氧核酶活性降低而且近乎失活。