大麦Isa-H1基因在玉米中遗传转化的研究

【摘要】：玉米是重要的粮食作物之一。玉米成熟期存在一种灾害,即遇到阴雨天气,穗上发芽,称之为穗发芽(PHS)。穗发芽能够导致玉米品质下降。大麦α-淀粉酶抑蛋白(BASI),可有效抑制α-淀粉酶活性,在小麦遗传背景中表达可改善淀粉品质和增加穗发芽抗性。所以本研究克隆了α-淀粉酶抑制蛋白基因Isa-H1和大麦胚乳特异启动子Horp,构建了植物高效表达载体pHorp-Isa-H1。建立了稳定的遗传转化体系,并通过农杆菌介导和花粉管转化的方法将其转入骨干玉米自交系。取得进展如下: 用PCR方法扩增Horp和Isa-H1全长,测序后将Horp、Isa-H1连接到切除35S和GUS基因的pCAMBIA3301载体上,最后获得植物表达载体pHorp-Isa-H1。在玉米遗传转化中,由于基因型限制,作为转化受体的自交系较少。本实验 从40个玉米自交系中筛选出优良玉米自交系Y412、Y423作为受体材料。发现这两个材料的幼胚均可大量高效的诱导出玉米体细胞胚胎,而且诱导出的体胚能够长时间继代无限繁殖,无外源激素调控就可两极同时分化以及分化率和成苗率极高等特点。 将构建好的植物表达载体pHorp-Isa-H1转化到农杆菌EHA105中,对玉米愈伤进行转化,PPT筛选抗性愈伤并分化成苗。对抗性植株进行了PCR分子检测,获得了13株转基因植株。 在转化受体系统选择时,发现玉米的茎节,离体培养具有双极性,能够快速成长为完整植株。随机选取了5个优良玉米自交系,对其进行了重复试验,结果证明此方法不存在基因型限制,转化周期也大大缩短,为玉米的遗传转化提供了一个新的受体系统。实验还直接对玉米的幼胚进行了转化试验。选取2个玉米自交系的幼胚,进行农杆菌侵染,结果发现这种方法简便易行,抗性苗成苗率高,克服了玉米遗传转化过程中基因型障碍问题,加快了玉米转基因研究进程。 利用花粉管通道法介导的遗传转化体系,将构建好的植物表达载体pHorp- Isa-H1转入玉米自交系,并成功获得了12株T0代转基因植株。将T0代种子以穗为单位收获后,提取了T1代胚乳DNA进行了PCR检测,结果显示,55%的T1种子都含有外源的目的基因,目前已获得T2代种子。