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重组奶牛神经肽Y基因在毕赤酵母中的分泌表达及生物学活性分析

吴殿君  
【摘要】:关于NPY对围产期奶牛物质代谢的研究中,牛淑玲博士发现:产前低能饲喂奶牛,产后奶牛血液中NPY的浓度高,奶牛食欲的恢复最快、干物质摄入量大且上升幅度也快,可提前达到干物质采食高峰且干物质采食高峰持续时间长;而产前高能饲喂奶牛,产后奶牛血液中NPY的浓度降低,且产后食欲的恢复慢,干物质摄入量少且上升幅度也慢,干物质采食高峰延迟。夏成博士的研究也发现血清NPY水平与血糖水平相关。奶牛体内的糖主要用于乳汁中的乳糖和组织器官的能量需要,而这大部分来源于肝脏的糖异生作用。PC与PEPCK是主要存在于肝脏中调节肝内糖异生重要的限速酶,它的表达水平和活性直接影响机体的糖代谢情况。 本实验室研究表明,NPY可促进单层培养的犊牛肝细胞PC与PEPCK的表达及活性,并具有一定的剂量依赖性和时间依赖性,这一结果与国内外报道基本一致。可见维持一定水平的NPY对于提高肝糖异生能力,改善体内糖代谢环境,缓解奶牛能量负平衡有着重要的作用。 为深入了解NPY的结构、功能、研究NPY与体内其他生物大分子之间的相互作用,以及NPY在奶牛能量代谢调控方面的作用,有必要利用基因工程技术原理将奶牛NPY成熟肽基因整合到表达载体上,使之实现高效表达,产生大量重组NPY。 巴斯德毕赤酵母表达系统具有基因操作简单、发酵生长速度快、外源蛋白表达量高、发酵成本低廉等优点。在酵母系统,其不仅克服了酿酒酵母的上述缺陷,还具有高等真核表达系统的蛋白翻译后的各种修饰作用,如蛋白磷酸化和糖基化修饰功能等。该系统所表达产物的免疫学活性和生物学功能与天然蛋白质较为接近。 本研究根据GenBank中的欧洲牛NPY基因序列(NM_001014845),设计NPY成熟肽基因改造引物,通过PCR扩增,克隆得到阳性重组质粒pMD18-T-FLAG-NPY,测序结果显示与设计的序列完全一致。利用毕赤酵母表达系统,采用目前较为常用的pPICZαA表达载体,进行重组奶牛FLAG-NPY融合多肽表达,并对表达产物进行初步纯化。通过表达产物的Tricine-SDS-PAGE分析与Western blotting鉴定,结果显示:毕赤酵母表达系统表达的重组融合多肽具有良好的免疫学活性。 通过体外犊牛肝细胞原代培养技术,运用实时荧光定量PCR (RTq-PCR)实验方法,检测了重组奶牛FLAG-NPY融合多肽对肝细胞中肝糖异生关键酶表达及活性的调控作用。实验结果显示:重组奶牛FLAG-NPY融合多肽对体外单层培养的牛肝细胞糖异生关键酶PC和PEPCK的mRNA转录水平及活性均有显著的上调作用。


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