BMSCs对脊髓损伤修复及其作用机制的研究

【摘要】：脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)是目前在世界范围内神经领域常见的疾患,其发病率呈现逐年递升的趋势。患者临床表现主要是中枢神经系统严重损伤的症状。细胞移植治疗是当今SCI治疗的研究热点之一,目前应用最多的是神经干细胞移植治疗。但因受伦理学、法律、及来源等方面的限制,给其临床应用带来巨大困难。骨髓间充质干细胞(Bone mesencymal stem cells,BMSCs)有较强的可塑性,具备了胚胎干细胞的生物学特性,已经成为治疗神经系统疾病理想的种子细胞。本研究应用脊髓神经元损伤的细胞模型通过体外实验观察BMSCs与脊髓损伤组织的相互作用。同时采用大鼠脊髓损伤动物模型,通过不同移植途径移植BMSCs,结合电刺激,通过BBB动物运动评分和神经诱导电位以及损伤局部的组织学变化,确定脊髓损伤的最佳修复条件。通过免疫荧光、实时定量PCR和Western Bloting技术分析不同途径BMSCs移植过程,BMSCs在脊髓组织中的迁移和相关趋化因子的表达,探讨BMSCs的体内迁移机制。 体外研究结果显示,正常和损伤的脊髓匀浆上清均能诱导BMSCs向神经细胞分化并表达NSE,但是损伤的脊髓匀浆上清液对BMSCs促分化的作用更强。体内研究结果显示,细胞移植和电刺激治疗SCI模型动物后,动物的神经电传导功能,运动功能均得到了不同程度的恢复。组织形态学结果显示,细胞移植组损伤局部可见散在的CM-Dil标记的BMSCs,组织内空泡数量明显少于模型组,提示BMSCs可以填充组织缺损并定居于损伤部位。免疫组织化学学结果显示,GFAP阳性细胞随脊髓损伤时间延长细胞数量增多,14d时达到高峰,移植组和电刺激组以及电刺激联合细胞移植组组的GFAP染色强度明显低于模型组,提示细胞移植和电刺激可以降低脊髓损伤后的组织瘢痕化。脊髓损伤后,神经细胞出现凋亡和坏死,14d后,损伤局部仅有少量的神经元存活,而电刺激组和BMSCs细胞移植组可见大量NF阳性的细胞和轴突分布于损伤区周围。电刺激联合细胞移植组NF阳性细胞明显多于单因素作用组,表明损伤局部有更多的神经元存活。这些存活的神经元可能得益于局部的神经元营养因子的分泌。我们通过检测BDNF的表达水平发现,BDNF表达在细胞移植组有明显的时间依赖性,在损伤后7d的局部组织BDNF表达灰度明显高于模型组,14d最强,在损伤后21d时间点BDNF表达减弱,BDNF的表达时效与脊髓损伤修复过程一致。电刺激组BDNF表达高于模型组,细胞移植联合电刺激组BDNF表达最强。 实验中采用了损伤部位移植和腰骶鞘内移植两种方法移植BMSCs,结果显示,腰骶鞘内移植后,模型动物神经功能、运动功能的恢复均较局部移植的效果好。在损伤后不同时间点,发现细胞移植7d时,移植细胞聚集在脊髓损伤部位,而在距损伤部位1 cm远处,移植的BMSCs明显减少。说明BMSCs移植对损伤部位具有明显的趋向性。通过检测损伤部位及远端脊髓的CXCL12和CXCR4表达,发现脊髓间质细胞CXCL12表达阳性细胞周围有大量的移植细胞,且表达强度随时间变化,在14d最强,21d时间点减弱。这些现象表明,CXCL12/CXCR4的相互作用介导移植的BMSCs主要向局部损伤组织迁移。损伤可诱导内皮组织正调节表达CXCL12,这种反应可能引起血浆和骨髓的CXCL12浓度的不平衡,出现短暂的CXCL12浓度梯度,从而使BMSCs易位进入局部损伤组织。