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纳米SiO_2颗粒对HepG2细胞的毒性及相关机制研究

孙磊  
【摘要】:纳米材料的生物效应及毒性的研究对于纳米科技的发展及纳米材料的广泛应用具有十分重要的意义。纳米SiO2颗粒在多个领域,特别是生物医药领域有广阔的应用前景。目前,对于纳米SiO2颗粒毒性及其机制的已经有一些报道,但与其应用并不同步,还有待深入,尤其是该颗粒对细胞凋亡的影响及机制研究并不系统。纳米SiO2颗粒易在肝脏中蓄积,是其作用的靶器官之一。本研究以人肝癌细胞株HepG2为研究对象,探讨纳米SiO2颗粒对细胞的毒性作用及其导致细胞凋亡的相关机制,为了解纳米SiO2颗粒的毒性和毒作用机制提供实验依据。 1.纳米SiO2颗粒的表征 TEM观察结果显示:纳米SiO2颗粒分布均匀,大小一致,颗粒呈球形,分散性好,未发生聚集,颗粒均呈球形,平均粒径为(43±3.5)nm。 DLS法检测结果显示:纳米SiO2颗粒分散于无血清DMEM培养液、含1%、5%、10%FBS的DMEM培养液中24 h,未经超声处理,测得水合粒径分别为(127.764±2.49)nm、(507.10±14.24)nm、(371.44±12.97)nm及(287.42±3.75)nm;超声处理5 min,测得水合粒径分别为(127.02±4.90)nm、(186.32±±7.89)nm、(185.34±10.46)nm及(187.68±10.75)nm。 2.HepG2细胞对纳米SiOz颗粒的摄取及颗粒在细胞内的分布 荧光显微镜观察显示:纳米SiO2颗粒作用于细胞3 h后,细胞内可见红色点状荧光纳米颗粒。TEM观察可见:纳米SiO2颗粒作用于细胞后,可粘附在细胞表面或分布于胞质中,同时颗粒可以沉积于线粒体、内质网及溶酶体等细胞器中。 3.纳米SiO2颗粒进入细胞的方式 TEM观察可见:纳米SiO2颗粒以单一颗粒或成簇的形态分布于胞质中,部分颗粒进入内吞泡及溶酶体中,另一部分则散在存在,无膜结构包被。此外,可见纳米SiO2颗粒直接穿过细胞膜,以“打孔”的方式进入细胞。 4.纳米SiO2颗粒对细胞存活率的影响 MTT检测结果显示:不同浓度纳米Si02颗粒作用于HepG2细胞3 h及24 h,随作用剂量增加,细胞存活率呈下降趋势,作用24 h各受试组与对照组比较差异均具有统计学意义(P0.05)。 5.纳米SiO2颗粒对细胞形态的影响 倒置相差显微镜观察可见:纳米Si02颗粒作用于HepG2细胞24 h,随着作用浓度的增加,细胞数逐渐减少,200mg/L组细胞形态明显改变,细胞呈不规则形状,细胞间连接破坏。TEM观察可见:200 mg/L纳米Si02颗粒作用24 h,细胞表面变光滑,微绒毛消失,胞质空化,细胞核边集;线粒体数量减少,肿胀,嵴断裂或消失;内质网出现扩张病理改变。 6.纳米SiO2对细胞内ROS的影响 流式细胞术检测显示:纳米Si02颗粒作用于HepG2细胞3 h及24 h后,25、50及100 mg/L组细胞内产生的ROS随颗粒作用浓度的增加而升高,但200 mg/L组细胞内ROS均较100 mg/L组有所下降,作用3 h,各受试组与对照组比较差异均有统计学意义(P0.05);作用24 h,50、100 mg/L组与对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。 7.纳米SiO2颗粒对细胞内Ca2+浓度的影响 流式细胞术检测显示:纳米Si02颗粒作用于HepG2细胞3 h及24 h,细胞内Ca2+浓度随颗粒作用浓度的增加而升高,50、100及200 mg/L组与对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。 8.纳米SiO2颗粒对细胞线粒体膜电位的影响 激光共聚焦扫描显微镜观察及流式细胞术检测显示可见:不同浓度纳米Si02颗粒作用于HepG2细胞3 h及24 h,随着颗粒作用浓度的升高,线粒体膜电位呈下降趋势,其中50、100及200 mg/L组与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05)。 9.纳米SiO2颗粒对细胞凋亡的影响 流式细胞术检测显示:不同浓度SiO2颗粒作用于HepG2细胞3 h及24 h,各受试组细胞的早期、晚期凋亡及坏死和总凋亡率随颗粒作用浓度的升高呈上升趋势,并存在剂量依赖关系。作用3 h,除25 mg/L组晚期凋亡及坏死率与对照组比较无明显差异外,其他各受试组与对照组比较差异均具有统计学意义(P0.05);作用24 h,50、100及200 mg/L组的早期、晚期凋亡及坏死和总凋亡率与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05)。不同浓度Si02颗粒同时加入Z-VAD-FMK作用于HepG2细胞3 h及24 h,各受试组细胞的早期、晚期及坏死和总凋亡率随颗粒作用浓度的升高呈上升趋势。 10.纳米SiO2颗粒对凋亡相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示:不同浓度SiO2颗粒作用于HepG2细胞24 h,随作用浓度的升高,各受试组Bcl-2蛋白的表达与对照组比较明显下降(P0.05),Bax蛋白表达与对照组比较无明显变化,但Bax/Bcl-2比值升高;100及200 mg/L组CytC蛋白的表达与对照组比较明显升高(P0.05),各受试组GRP78、CHOP及AIF蛋白的表达与对照组比较明显升高(P0.05),50、100及200 mg/L组JNK及Caspase-3蛋白的表达与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05)。 综上所述,本研究中纳米SiO2颗粒在无血清DMEM中分散性较好,培养体系中的血清可以影响颗粒的粒径、粒径分布及分散性。纳米SiO2颗粒作用于HepG2细胞后,颗粒可以不同方式进入细胞并在胞质及细胞器内沉积,而且胞内的颗粒可对细胞膜及细胞器产生的直接毒性作用,细胞内ROS及Ca2+浓度的升高是其细胞毒性的主要机制,线粒体是颗粒毒性作用的靶细胞器之一,这些机制共同作用导致细胞凋亡或坏死,降低细胞存活率。纳米Si02颗粒导致HepG2细胞的凋亡由线粒体通路、内质网通路及AIF参与的Caspase非依赖通路介导,同时细胞内ROS产生及Ca2+浓度的升高也与细胞凋亡有关,各种因素对细胞凋亡的调控存在'crosstalk"机制。


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