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Ang/Tie-2在结直肠癌中的表达及其分子机制的研究

张继红  
【摘要】:随着人们生活水平的提高,结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势。结直肠癌的早期治疗主要以手术为主,晚期辅以放、化疗,其主要死亡原因在于肿瘤的复发及转移。近年研究发现,肿瘤的生长主要依赖于血管的增殖,随着分子生物学技术的发展,通过抑制血管生成从而达到抗肿瘤的基因治疗成为可能。血管生成素(angiopoietins, Ang)是新近发现的参与生理性和病理性血管生成的一簇蛋白分子,根据功能不同分为4种:Ang-1、Ang-2、Ang-3及Ang-4,其中Ang-1和Ang-2是Ang家族中最主要的两个成员。内皮细胞本身并不分泌Ang-1,而是由内皮细胞旁细胞(如平滑肌细胞)、造血干细胞等细胞分泌。Ang-1主要有抑制内皮细胞凋亡、促进内皮细胞出芽及稳定血管等作用。Ang-2由内皮细胞及内皮细胞旁细胞分泌,主要通过竞争性抑制Ang-1形成不稳定的渗漏性血管。Tie是内皮细胞特有的酪氨酸激酶受体,分Tie-1和Tie-2两种。Tie-2又称作TEK,特异表达于血管内皮细胞(包括毛细血管和动、静脉)和造血干细胞,通过募集细胞内不同的结合蛋白发挥不同的作用,是Ang的共同受体。 Ang-1、Ang-2作为Tie-2的配体,与Tie-2形成Ang/Tie-2系统,而Ang-2/Tie-2系统在肿瘤的血管生长过程中具有重要的作用,因此通过阻断该系统的信号转导途径抑制肿瘤血管生长从而治疗肿瘤成为可能。目前已经证实,Ang-2蛋白及其受体Tie-2与胃癌、恶性胶质瘤、乳腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤之间具有密切关系,但三者与结直肠癌之间的系统研究鲜有报道。 磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt或PI3K/PKB)是与细胞增殖和细胞凋亡关系最密切的信号转导通路之一,主要抑制细胞凋亡,促进细胞周期的进行、肿瘤的侵袭及血管形成。PI3K/Akt通路在肿瘤的发生、发展中起着重要作用,且在肿瘤细胞逃避抗癌药物的杀伤过程中,该信号转导通路也可能具有极其关键的作用,因此PI3K/Akt信号转导通路有望成为恶性肿瘤治疗的新靶点。目前,有关PI3K/Akt信号转导通路与卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及口腔鳞状细胞癌等恶性肿瘤之间的关系已有一些相关报道,但该通路在结直肠癌发生、发展中的作用及其相关机制罕见报道。 LY294002为PI3K通道抑制剂,可以通透细胞,特异性抑制PI3Kp110亚单位的催化活性,从而抑制肿瘤细胞增生。LY294002能使卵巢癌MDR细胞对紫杉醇更加敏感,且能有效提高化疗药物对胃癌细胞的增殖抑制作用,显著提高化疗药物的疗效,但迄今为止,国内外关于LY294002对结肠癌细胞的抑制作用尚未见报道。 本研究应用免疫组织化学方法(S-P法),对结直肠癌100例、癌旁正常组织(距癌周2cm)10例的石蜡切片标本进行了Ang-1、Ang-2、Tie-2、PI3K及Akt蛋白表达情况的检测;应用RT-PCR及Western blot技术检测20例手术切除的新鲜结直肠癌标本及其癌旁组织中五种基因及蛋白的表达。体外实验中,在无血清培养液培养的基础上,以外源性Ang-1、Ang-2蛋白刺激结肠癌HCT-8和SW1116细胞株,同时加入PI3K通道抑制剂LY294002,观察两种细胞Tie-2、PI3K及Akt基因及蛋白表达的变化。通过体内外相结合、免疫组织化学与Western blot相互验证的方法,探讨Ang-1、Ang-2蛋白与结直肠癌之间的关系,旨在阐明结直肠癌发生发展的可能性分子机制。 本研究的主要结果如下: 1.结直肠癌组织中Ang-2、Tie-2、P13K及Akt基因及蛋白的表达明显高于癌旁正常组织;且低分化腺癌的蛋白表达高于高、中分化腺癌;Dukes分期中的C、D期的蛋白表达高于A、B期;有淋巴结转移组的蛋白表达高于无淋巴结转移组。 2.结直肠癌组织中Ang-1基因及蛋白的表达明显低于癌旁正常组织;且低分化腺癌的蛋白表达低于高、中分化腺癌;Dukes分期中的C、D期的蛋白表达低于A、B期;有淋巴结转移组的蛋白表达低于无淋巴结转移组。 3.结直肠癌组织中Ang-2与Tie-2、Ang-2与PI3K、Ang-2与Akt、Tie-2与P13K、Tie-2与Akt及PI3K与Akt的蛋白表达呈正相关(P均0.01)。 4.外源性Ang-1及Ang-2蛋白对两种结肠癌细胞株(HCT-8及SW1116)均有促增殖作用。 5.外源性Ang-1、Ang-2蛋白促进结肠癌HCT-8及SW1116细胞株Tie-2、PI3K及Akt基因及蛋白的表达增强。 6.PI3K通道抑制剂LY294002使两种细胞内Tie-2、PI3K及Akt基因及蛋白的表达减弱。 本研究的结论: 1.结直肠癌组织中Ang-2、Tie-2、PI3K及Akt的基因及蛋白表达明显高于癌旁正常组织;且其蛋白的表达与结直肠癌发病人群的性别、部位、组织学类型无关,而与分化程度、Dukes分期及淋巴结转移有关:分化程度越低、Dukes分期越高及有淋巴结转移的结直肠癌组织中,四种蛋白的表达越强。 2.结直肠癌组织中Ang-1的基因及蛋白表达明显低于癌旁正常组织;其蛋白的表达与结直肠癌发病人群的性别、部位、组织学类型无关,而与癌组织分化程度、Dukes分期及淋巴结转移有关:分化程度越低、Dukes分期越高及有淋巴结转移的结直肠癌组织中Ang-1蛋白的表达越弱。 3.外源性Ang-1及Ang-2蛋白均能促进结肠癌HCT-8及SW1116细胞株的细胞增殖。 4.外源性Ang-1及Ang-2蛋白促进结肠癌细胞增殖是通过Ang/Tie-2/PI3K/Akt信号转导通路起作用,Ang/Tie-2/PI3K/Akt信号转导通路在结直肠癌的发生发展中起重要作用。 5.PI3K抑制剂LY294002可有效抑制结肠癌HCT-8及SW1116细胞株的增殖,可通过降低细胞内Tie-2、P13K及Akt基因及蛋白的表达抑制结直肠癌的发生及发展。 本研究的主要创新点: 1.在免疫组织化学染色的基础上,首次应用RT-PCR及Western blot技术系统地检测结直肠癌组织中Ang-1、Ang-2、Tie-2、PI3K及Akt基因及蛋白的表达情况。 2.首次应用外源性Ang-1及Ang-2蛋白刺激结肠癌细胞株(HCT-8及SW1116),两种蛋白对两种细胞均有促增殖作用。 3.首次应用免疫组织化学、RT-PCR及Western blot技术方法,探讨外源性Ang-1、Ang-2蛋白刺激两种结肠癌细胞株引起细胞增殖而产生的分子机制:即Ang-1、Ang-2蛋白促进结肠癌细胞增殖是通过Ang/Tie-2/PI3K/Akt信号通路起作用,且该通路可有效地被LY294002抑制。


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