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己糖-6-磷酸脱氢酶和11β-羟基类固醇脱氢酶1的相互调节在2型糖尿病发病机制中的作用

范征  
【摘要】:糖尿病是严重危害人类健康的一种慢性疾病,全世界发病率约5%,并呈逐年上升趋势。它是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱,伴有因胰岛素分泌和/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢异常。其中以2型糖尿病发病居多,约占糖尿病患者90%以上。2型糖尿病发病以胰岛素抵抗为主,伴胰岛素分泌不足。鉴于目前该病发病率高、并发症多的特点,寻找一种有效的治疗靶点是当前研究的热点。 糖皮质激素参与了代谢紊乱综合症的病理生理改变,包括高血压、肥胖和2型糖尿病。糖皮质激素通过增加肝糖异生,抑制胰岛素降糖效应从而拮抗胰岛素的作用。异常的肝糖异生导致了2型糖尿病病人的空腹高血糖和餐后高血糖。组织糖皮质激素活化在受体前水平受11β-HSD1调节,而11β-HSD1的活化依赖于H6PDH提供NADPH,然而H6PDH和11β-HSD1相互调节在2型糖尿病发病机制中的作用尚不清楚。本课题通过两次低剂量STZ腹腔注射联合高脂饮食成功构建了2型糖尿病大鼠模型,观察糖尿病大鼠肝脏H6PDH和11β-HSD1表达及活性,肝组织的皮质酮含量以及肝糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的蛋白表达。结果显示糖尿病组肝脏H6PDH和11β-HSD1的表达和活性均显著高于正常组,肝组织的皮质酮含量明显增高,并且糖尿病组PEPCK和G6Pase的表达也显著高于正常组,说明H6PDH和11β-HSD1可能诱导糖尿病的糖异生关键酶异常激活,增强糖异生作用。为了证明此观点,我们构建H6PDH和11β-HSDlsiRNA干扰质粒,在细胞水平分别抑制H6PDH和11β-HSD1的表达,观察两者之间的相互作用,以及皮质酮处理的肝细胞H6PDH的表达被抑制后对PEPCK及下游胰岛素信号通路的影响。结果显示H6PDH siRNA和11β-HSD1 siRNA可以互相抑制彼此蛋白表达及活性;10-6M皮质酮持续刺激大鼠肝细胞48 h可增加PEPCK的蛋白表达,降低胰岛素对PEPCK表达的抑制作用,并且降低胰岛素信号通路蛋白IR-β、IRS-1、Akt、p-Akt的表达,产生肝胰岛素抵抗。用H6PDH siRNA预先抑制H6PDH表达后,皮质酮上调PEPCK的作用减弱,且恢复胰岛素抑制PEPCK表达及增强胰岛素信号通路相关蛋白表达的作用。说明抑制H6PDH可以阻断皮质酮刺激的糖异生增强作用及逆转皮质酮产生的胰岛素抵抗作用:因此,H6PDH和11β-HSD1可作为2型糖尿病和代谢综合征治疗的有效靶点 11β-HSD1在体内受到很多激素和生长因子的调节.包括糖皮质激素、胰岛素和生长激素。血中葡萄糖的浓度和胰岛素分泌量是交互影响的,进食后血中葡萄糖浓度升高,促进胰岛素分泌,降低血糖,使其维持在正常水平。尽管目前有关胰岛素和葡萄糖对11β-HSD1的作用已有研究,但对H6PDH的作用尚无报道,而且胰岛素和葡萄糖对H6PDH和11β-HSD1的作用是直接的还是间接的也仍不清楚。本课题在成功建立高脂饮食联合小剂量STZ诱导糖尿病大鼠模型基础上,分别从mRNA水平、蛋白水平和酶活性三个方面检测了空腹和饱腹状态下糖尿病大鼠和正常大鼠肝脏H6PDH和11β-HSD1的变化,观察血糖与两者之间的关系,结果显示糖尿病大鼠H6PDH和11β-HSD1的表达和活性均高于正常大鼠,且糖尿病饱腹组的血糖最高,变化趋势和血糖一致,说明随着血糖的增高,H6PDH和11β-HSD1表达也增高。同时还检测了GR的表达,发现无论是mRNA水平还是蛋白水平,糖尿病饱腹组的GR表达都是最高。相关性分析显示H6PDH和11β-HSD1都与血糖相关性很好,而与血清胰岛素无相关性。我们在细胞水平进行验证,用含不同浓度葡萄糖的培养基培养原代肝细胞,结果显示随着葡萄糖浓度的增高,H6PDH和11β-HSD1的活性及表达均增高.且GR、PEPCK、G6Pase表达也增高。用不同浓度H6PDH的底物G6P处理原代肝细胞后,H6PDH和11β-HSD1的表达随着G6P浓度的增加而增高。胰岛素处理低糖培养的原代肝细胞后H6PDH和11β-HSD1表达无变化,并且葡萄糖消耗无明显改变,而处理高糖培养的细胞后H6PDH和11β-HSD1表达发生改变,且随着胰岛素浓度的增加表达下调,同时葡萄糖消耗明显增加,说明葡萄糖对H6PDH和11β-HSD1具有直接调控作用,而胰岛素则是通过调节葡萄糖的浓度间接调控H6PDH和11β-HSD1。我们在细胞水平进一步观察葡萄糖浓度对H6PDH和11β-HSD1干扰作用的影响,以及不同葡萄糖浓度条件下干扰对糖异生关键酶PEPCK的影响。结果显示低浓度或高浓度葡萄糖不影响H6PDH和11β-HSD1相互作用。在低糖状态下,H6PDH siRNA和11β-HSD1 siRNA对PEPCK表达无明显影响,而在高糖时,H6PDH siRNA和11β-HSD1 siRNA明显降低PEPCK表达。当培养基中葡萄糖从低浓度转变为高浓度后,H6PDH siRNA和11β-HSD1 siRNA亦可使PEPCK蛋白表达下调。结果说明H6PDH siRNA和11β-HSD1 siRNA对PEPCK抑制作用主要受到葡萄糖浓度的影响,这为H6PDH和11β-HSD1 siRNA作为特异性的抑制剂在临床上治疗糖尿病提供了一个新思路,提示H6PDH和11β-HSD1特异性抑制剂有望成为抗糖尿病药物,而可能不引起低血糖反应


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