重组表达NT4-CGRP腺相关病毒的构建及对鸡胚血管痉挛的治疗作用研究

【摘要】：CVS是SAHH后的较为严重的并发症之一,具有发病率高及死亡率高的特点。但由于其发病机制并不明确,因此目前尚无确切治疗CVS的方法。所以选择一种合适的动物模型研究其发病机制,并寻找一种有效的方法防治CVS是解决问题的关键。目前大量的研究证实CGRP是已知最强的扩血管物质,并在临床实践及基础研究中证实应用CGRP可以有效的防治CVS。但由于外源性的CGRP无法通过血脑屏障,因此血药浓度难以维持,故治疗效果不佳。本实验设计采用鸡胚CAM血管制作CVS模型,CAM血管组织形态接近人脑血管,在成模后可随时动态观察血管形态,具有连续性好、周期短、成功率高及可重复操作的特点,这样就弥补了其他动物模型的许多不足。实验拟通过PCR等分子生物学技术,并应用转基因的方法,包装出带有表达核NT4-CGRP融合基因的腺相关病毒；利用病毒感染鸡胚CAM血管内皮细胞,使其长期稳定的表达分泌内源性CGRP治疗CVS。 (1)鸡胚CAM血管痉挛模型的建立 目的：寻找诱导建立鸡胚CAM血管痉挛的最适宜血红蛋白浓度,构建鸡胚CAM血管痉挛模型。 方法：采用随机对照分组的方法向鸡胚CAM上加入不同浓度的OxyHb溶液(0umol/L、1 umol/L、5 umol/L、10 umol/L、20 umol/L、100 umol/L、200 umol/L),并再加入尼莫地平溶液进行干预。在不同时相6h,12h,24h,2d,3d,5d,7d时对各组进行数码相机拍照,而后采用IPP显微镜及图像分析软件对鸡胚CAM血管面积百分比进行检测及分析。所有数据以平均数±标准差(X±s)表示,组内及组间数据均采用完全随机设计的方差分析和多个样本均数多重比较的方法,应用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析,以P0.05差异为具有统计学意义。显微镜下对鸡胚CAM血管的切片进行病理学检查,观察血管形态、内皮有无皱褶及脱落等。 结果：1)在较高浓度下(100umol/L、200umol/L),鸡胚在CAM血管并未出现痉挛时就已经死亡；而在较低浓度下(1umol/L、5 umol/L),实验组的CAM血管与对照组的血管比较无明显统计学差异(P0.05)。最终发现在OxyHb浓度为10umol/L时血管痉挛较为明显而且不会导致鸡胚死亡。2)病理检查时对照组7个不同时相均可见鸡胚CAM的血管内皮细胞呈扁平状,内弹力膜层光滑平坦,血管平滑肌排列整齐,外膜光滑；加入OxyHb溶液后第3、5和7天可见血管内皮细胞严重变性,部分出现坏死及脱落,形状不规则,细胞间隙明显增大,内弹力膜层明显皱褶、增厚,平滑肌失去正常的梭形形态,并有空泡形成及肿胀。3)给予尼莫地平进行干预后,见组间CAM的血管百分比与对照组相比统计学差异明显(P0.05),病理检查可见血管形态、内皮皱褶及脱落较OxyHb组显著改善。 结论：诱导鸡胚CAM血管痉挛的最适宜血红蛋白浓度为10umol/L,鸡胚CAM血管与其他哺乳动物脑动脉血管的内皮相似,均对OxyHb敏感,并且对尼莫地平的干预敏感。证明鸡胚CAM的CVS模型是一类成功的CVS模型,为研究CVS的发病机制提供了新的方法。 (2)构建重组表达CGRP的腺相关病毒 目的：构建能分泌表达CGRP的重组腺相关病毒。 方法：应用融合基因和重组病毒包装技术构建可分泌表达CGRP的重组腺相关病毒。1)采用PCR的方法获得CGRPcDNA。2)将目的基因CGRP与带有信号肽NT4的原核表达载体PBV220-NT4进行亚克隆,构建融合基因NT4-CGRP.3)转染293细胞,包装出带有融合基因NT4-CGRP的重组腺相关病毒。4)应用实时定量PCR技术测定病毒滴度。5)通过重组腺相关病毒感染3T3细胞,行免疫组化测定病毒分泌表达CGRP的情况。 结果：琼脂糖凝胶电泳结果证实融合基因正确插入了病毒载体PSS-CMV,应用实时定量PCR方法测定病毒滴度为2×108,免疫组化结果确定了病毒表达。 结论：成功的构建了能分泌表达CGRP的重组腺相关病毒。 (3)重组腺相关病毒治疗鸡胚CAM的血管痉挛 目的：研究分泌表达CGRP的重组腺相关病毒对鸡胚CAM血管痉挛的治疗作用。 方法：将发育至第7日的鸡胚160只,随机分为生理盐水对照组20只；OxyHb组70只：而后随机分为7小组,每组10只；OxyHb+CGRP病毒组70只：随机分为7小组,每组10只。再分别向鸡胚CAM中加入生理盐水、OxyHb及OxyHb+CGRP,而后按不同时相6h,12h,24h,2d,3d,5d,7d时对各组进行数码相机拍照,并采用IPP显微镜及图像分析软件对鸡胚CAM血管面积百分比进行检测及分析。所有数据以平均数±标准差(X±s)表示,组内及组间数据均采用完全随机设计的方差分析和多个样本均数多重比较的方法,应用SPSS 10.0统计软件进行数据分析,以P0.05为差异有统计学意义。显微镜下对鸡胚CAM血管的切片进行病理检查,观察血管形态以及内皮有无皱褶脱落等。 结果：发现在较早的时相(6-24h)中：OxyHb+CGRP组与OxyHb组之间CAM的血管面积百分比组间无统计学差异(P0.05),病理改变无明显差异；在后期的时相(3-7d)中,血管面积百分比组间统计学差异明显(P0.05)。取病理后可见OxyHb+CGRP组的内弹力膜层皱褶、增厚以及细胞脱落、坏死与OxyHb组相比明显减轻。 结论：构建的重组腺相关病毒载体能够高效的转染鸡胚CAM血管内皮细胞,并能分泌表达出CGRP,对CAM血管痉挛可以起到治疗作用。从而为CVS的临床防治提供了一种新途径,具有广阔的发展前景。