联合应用重组人骨保护素和磷酸钙骨水泥增强骨质疏松转子间区力学性能的实验研究

【摘要】：目的： 老年骨质疏松性股骨转子间骨折的发病率与日俱增。股骨转子间骨折是骨质疏松症中最常见的疾病,给家庭和社会带来沉重的负担。早期预防严重骨质疏松造成的转子间骨折至关重要。骨保护素(osteoprotegerin,OPG)具有抑制破骨细胞的功能,抑制骨吸收,增加骨量。应用重组骨保护素治疗绝经期妇女骨质疏松已取得临床疗效。本研究拟采用酵母菌SMD1168构建新的OPG-Fc表达菌株—MD1168/OPG-Fc,获得rhOPG-Fc融合蛋白；在转子间区注射磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate cement,CPC),探讨注射CPC后股骨转子间区力学性能的改变情况；制作骨质疏松动物模型,于疏松股骨转子间区注射CPC并同时皮下注射rhOPG-Fc融合蛋白,研究骨质疏松性的股骨转子间区骨质内骨水泥的降解和成骨情况。 方法： 选择OPG功能片段(D1-D4)作为目的基因一,并选取IgG1的Fc片段作为目的基因二,利用RT-PCR技术获得编码OPG(D1-D4)和IgG1-Fc的基因,继而构建分泌型表达载体pPICZα/OPG-Fc,使用酵母菌SMD1168构建新的OPG-Fc表达菌株—MD1168/OPG-Fc经发酵获得rhOPG-Fc融合蛋白。 6对尸体股骨上段标本,左侧在股骨转子间区注入CPC,右侧为对照侧。记录注射的骨水泥量及推注力。尸体标本仿人单腿站立用牙托粉浇铸固定,在转子周围根据转子间区力线分布粘贴应变花,然后施以垂直方向的载荷,记录同一标本注射CPC前后各测试点的应力变化情况；比较实验侧和对照侧生物力学性能的差异。 骨质疏松动物模型的制备：20只雌性SD大鼠,随机分为两组：切除卵巢组(Ovx)和假手术组(Sham)。分别于术后3月、6月处死,处死前13天和3天进行荧光素标记并测定大鼠全身骨密度。股骨转子切片进行骨组织形态计量学检测。比较Ovx组和Sham组在组织学、骨密度、电镜等各项指标的差异。 研究疏松骨质对联合应用重组骨保护素及注射CPC后的成骨反应：30只骨质疏松的大鼠,随机分为3组：对照组,CPC注射组,联合应用注射rhOPG-Fc及CPC组。动物于处死前28天开始皮下注射rhOPG-Fc蛋白3mg/kg/d,连续注射14 d,将CPC注入股骨转子间区。于注射后第1、3、7天和1、3、6月分别处死并截取股骨上段,制成不脱钙骨切片,通过镜下观察及用组织形态学的方法研究CPC的降解和成骨情况。用扫描电镜(SEM)检测CPC与疏松骨质的整合情况。 结果： 所选OPG目的基因成功扩增,构建分泌型表达载体pPICZα/OPG-Fc获得成功；使用酵母菌SMD1 168构建的OPG-Fc表达菌株—MD1168/OPG-Fc,经发酵获得rhOPG-Fc融合蛋白；尸体标本转子间区能注射CPC量为18-25ml(平均21.2m1),在整个转子间区均匀分布。注射CPC后24小时最大压应力测点抗压强度比注射前提高24%；标本刚度也明显提高。在破坏载荷下,注射CPC侧标本能承受的最大载荷比对照侧明显增加(P0.05)。 骨质疏松动物模型的制备：大鼠全身骨扫描结果显示,Sham组骨密度明显较Ovx组高。镜下观察发现去势大鼠皮质骨明显变薄,骨小梁变细、骨小梁数目减少,骨小梁间距增宽,排列稀疏,结构变化明显。骨组织形态计量学结果证明：Sham和Ovx组间差异显著。 骨质疏松骨质对联合应用rhOPG-Fc融合蛋白和注射CPC的成骨反应：骨质疏松大鼠转子间区CPC水泥出现明显的骨传导现象。CPC注射部位出现成骨细胞和破骨细胞聚集现象,骨水泥逐渐吸收,大量新骨逐渐形成,两者之间出现明显的骨水泥-骨过渡带。注射后6月时矿化骨小梁面积明显增加。新生骨小梁与骨水泥结合紧密,骨水泥的吸收和新骨生成基本持平；联合应用rhOPG-Fc及局部注射CPC的标本骨形成更为明显,骨切片观察及透射电镜检查结果更接近于正常骨质。 结论： OPG基因可构建分泌型表达载体pPICZα/OPG-Fc并转化酵母菌SMD1168构建表达菌株；磷酸钙骨水泥可以顺利地注射入股骨转子间区并明显增强局部的生物力学性能。在骨质疏松的转子间区内,联合应用rhOPG-Fc融合蛋白和局部注射CPC具有更为明显的诱导新骨生成的作用,CPC能与宿主骨融合。