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激活素A-卵泡抑素系统在肝损伤中的作用研究

于昉  
【摘要】:激活素(Activin)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族成员,具有广泛的生物学活性,从胚胎形成到机体发育、成熟均发挥重要的作用。其对肝脏的作用,主要表现为诱导肝实质细胞凋亡、促进肝星形细胞(HSC)产生细胞外基质、参与肝纤维化的形成。激活素主要包括三种分子形式,Activin A、ActivinB和Activin AB。以Activin A的研究最多,其与肝脏的关系也最为密切。当肝纤维化时,肝细胞中的Activin A表达增加,HSC中也可以检测到Activin A的表达,多分布在纤维化形成的区域,此时HSC表达的Activin A可能是肝纤维化时的主要来源。体外实验还证明Activin A可以促进HSC分泌Ⅰ型胶原,可以增强TGF-β1的作用,是TGF-β1单独发挥作用的2-3倍,TGF-p在诱导肝纤维化时,部分依赖于内源性Activin A的作用。在肝炎、肝纤维化及肝癌等病变中,都可以见到Activin A的异常改变。 激活素的作用与受体后信号传导差异有关,其受体属于丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶型受体,信号传导调节由三部分组成,包括细胞外、受体和受体后信号传导调控。激活素首先与细胞外的Ⅱ型受体(ActRII)结合,再招募Ⅰ型受体(ActRI),并使后者活化,进一步激活下游Smad蛋白,传导信号入核内。卵泡抑素(Follistati, FS)作为激活素结合蛋白,与激活素高亲和力结合,从而阻断激活素的生物学效应,参与激活素信号传导的细胞外调节。激活素A与FS的表达平衡与多种生理病理状态有关,但二者在急性肝损伤、尤其是酒精性肝损伤中的作用仍不清楚。 本研究利用酒精诱导小鼠急性肝损伤,探讨小鼠肝组织Activin A、FS的表达情况,再通过阻断Activin A和ActRIIA作用实验,研究Activin A在急性肝损伤中的作用。刀豆蛋白A (Con A)近年来被用于急性肝损伤的研究,一次大量注射Con A通过其对肝细胞的直接毒性而诱导小鼠急性肝损伤,小量多次注射Con A还可模拟免疫性肝损伤。为了验证在急性肝损伤时是否都有ActivinA-FS系统的参入,实验进一步采用Con A诱导小鼠急性肝损伤,进一步探讨小鼠肝组织Activin A、FS的表达情况,并通过阻断Activin A和ActRIIA作用实验,验证Activin A在急性肝损伤中的作用。为了较全面阐述Activin A-FS系统与酒精性肝损伤的关系,研究还进一步建立了酒精性慢性小鼠肝损伤模型,分析Activin A及FS的表达与肝损伤的关系。 酒精诱导的急性肝损伤模型中,用含乙醇的饮用酒(5g/kg体重)给小鼠灌胃,间隔12h一次,连续三次。ConA诱发的急性肝损伤模型,采用Con A 15 mg/kg体重小鼠尾静脉注射。于给药结束后1d、3d、5d、7d四个时间点处死小鼠,留样品进行相关指标的检测。血清转氨酶ALT及AST检测显示,急性肝损伤模型鼠血清酶ALT及AST Id最高,然后逐渐降低,与HE染色肝病理结果一致,提示实验成功地诱导了小鼠急性肝损伤。酶联免疫吸附试验及荧光实时定量PCR检测结果显示,在酒精及Con A诱导的急性小鼠肝损伤实验动物模型的肝组织中,Activin A mRNA及蛋白的表达均增高,FS mRNA及蛋白的表达在肝损伤组无明显变化,肝损伤组Activin A/FS比值升高。ActRⅡA mRNA转录水平也升高,ActRⅡA与Activin A的表达呈正相关,与ALT及AST水平变化呈平行关系。上述结果提示小鼠肝损伤时Activin A-FS系统表达失衡,以Activin A表达升高为主,Activin A-ActRIIA信号途径活化参与了Activin A介导的急性肝损伤过程。 为了进一步确定Activin A介导急性肝损伤,实验采用抗Activin A抗体中和内源性Activin A以及抗ActRIIA抗体阻断Activin A与其受体作用的信号传导.观察对酒精及Con A诱导的急性小鼠肝损伤的影响。利用小鼠建立阻断实验模型,酒精诱导的模型中,于第二次及第三次灌胃前30min,尾静脉注射抗Activin A抗体或抗ActRⅡA抗体;Con A模型于注射Con A 4 h后尾静脉注射抗Activin A抗体或抗ActRⅡA抗体;实验结果表明,酒精及Con A作用后能够明显刺激血清ALT及AST水平升高,应用抗Activin A抗体中和内源性ActivinA作用或应用抗ActRⅡA抗体封闭Activin A与其受体结合,均能明显降低血清ALT及AST水平,HE染色显示抗Activin A抗体及抗ActRⅡA抗体的阻断实验组肝病理损伤也较轻。同时利用流式细胞术及MTT法检测小鼠免疫细胞活性的变化,结果均提示,实验组的T细胞免疫功能增强,可能是进一步导致肝细胞功能损伤的原因。上述结果进一步证实Activin A-ActRⅡA途径参与了急性小鼠肝损伤过程。 为了较全面的阐述Activin A-FS系统在酒精性肝损伤中的作用,实验进一步采用连续6周给予酒精饲养小鼠诱导慢性肝损伤,于给药结束后1d、3d、5d、7d四个时问点处死小鼠,留样品进一步检测肝损伤情况以及Activin A与FS的表达情况。研究显示酒精诱导慢性肝损伤小鼠的血清酶ALT及AST水平明显高于正常饮用水组,HE染色结果显示酒精诱导慢性肝损伤小鼠的肝组织明显受损,上述资料表明实验成功建立了酒精诱导的慢性小鼠肝损伤模型。采用实时定量RT-PCR检测的结果表明,Activin A及ActRⅡA mRNA的表达在酒精诱导的慢性肝损伤中明显升高,FS mRNA表达在肝损伤组中略高,肝损伤组ActivinA/FS比值升高,进一步采用抗Activin A及FS抗体进行免疫组织化学染色,其结果与Activin A及FS mRNA表达一致,进一步表明Activin A-FS系统表达失衡与酒精性肝损伤密切相关。 综上所述,Activin A-FS系统表达失衡可能是导致肝损伤的重要原因,其特征是以Activin A升高、Activin A-ActRⅡA途径活化为主,内源FS阻断ActivinA效应不足,导致升高的Activin A介导了肝细胞的损伤。因此,调节肝组织Activin A表达或阻断其作用途径可能对预防和治疗肝损伤具有重要意义。


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