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静电纺PBS纳米纤维膜及缓释血小板内生长因子的PBS纳米纤维膜的制备及生物活性评价

孙淑芬  
【摘要】:在口腔临床工作中,经常会发现有牙槽骨质的缺损,例如,慢性根尖周炎、牙周炎及牙齿拔除所引起的骨缺损,骨缺损不仅影响到牙齿的功能,也影响义齿的修复及种植。 人们采用许多方法促进牙槽骨形成,其中植入具有骨引导作用的生物材料和具有骨诱导作用的生长因子的方法,因其无创伤、效果稳定已经逐渐成为一种发展趋势。富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)和第2代血小板浓缩品富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)内含有大量高浓度的细胞生长因子,这些生长因子参与损伤愈合的过程,尤其是在骨再生中起重要作用。它们在各自发挥作用的同时,又相互促进、协作、调控,构成了一个具有组织修复功能的调节系统,可以促进组织愈合,调节炎症和抗感染。 然而,PRP及PRF的临床效果仍存有争议,出现许多相反的研究结果。有许多研究表明PRP及PRF的效果并不理想。研究发现生长因子的活性维持时间较短,不能满足成骨时间上的要求。因此,要保持生长因子的持续释放,就需要一种合适的支架材料。 在成骨研究中有机高分子支架材料是研究热点之一,理想的支架材料应容易负载生长因子并具有缓释效果,既能保护生长因子的生物活性,又可以维持生长因子缓慢释放,从而持续促进细胞生长及组织修复再生。聚丁二酸丁二醇酯[poly(butylene succinate),PBS]是一种生物可降解脂肪族聚酯,具有良好的细胞和组织相容性,完全的生物降解性、可被多种微生物或动植物体内的酶分解、最终代谢分解为二氧化碳和水,PBS作为潜在的生物医用高分子材料,其应用研究受到广泛关注。 纳米纤维因具有比表面积高及多孔结构的特点,在药物控释、人工皮肤、创伤愈合、牙齿增强等医学领域都有应用。近年来,采用静电纺丝制备聚合物的纳米纤维已经被应用到骨组织工程领域。 静电纺丝法制备PBS纳米纤维已有报道,但研究多集中在纺丝条件、纺丝参数、力学性能、热性能及改性等方面。对其作为骨替代材料的基础性研究却鲜见报道。用静电纺丝法将加入PRP的PBS制备成纳米纤维及其对成骨细胞的影响还未见报道。 本文采用静电纺丝法制备了PBS纳米纤维膜、PBS和PRP的混合纳米纤维膜(PBS/Platelet)。探讨两种支架材料的表面性质、亲水性、拉伸强度及对人骨肉瘤细胞系MG63细胞增殖、分化的影响,用real-time PCR法检测了成骨相关基因并用Western Blot检测了成骨相关蛋白的表达。 1PBS和PBS/Platelet纳米纤维膜的制备及表征 目的:探讨PBS纺丝最佳浓度及工艺参数,PRP加入PBS溶液进行静电纺丝的可行性。探讨两种支架材料的表征、亲水性、拉伸强度。 方法:以氯仿为溶剂溶解PBS进行静电纺丝。PRP加入PBS氯仿溶液中,超声振荡制备成乳液纺丝。通过扫描电镜观察材料表面,进行亲水性及拉伸强度的力学测试。 结果:所得纤维膜肉眼观察:质地均匀,弹性良好。在电子显微镜下,PBS纳米纤维的直径约在200~900nm之间,孔隙多,彼此交通;PBS/Platelet纳米纤维膜与PBS纳米纤维膜纺丝效果相似,PBS/Platelet纳米纤维的直径约在100~1000nm。PBS的的亲水角是68.81°±0.3°。说明材料亲水性尚可。纤维膜的拉伸强度分布在2.04±0.65~2.25±0.72(MPa),断裂伸长率在284.5±17.41~297.53±25.13(%)。加入PRP纳米纤维的弹性模量降低,断裂伸长率稍有增加。 2纳米纤维膜体外降解及PBS/Platelet纳米纤维膜的体外释放 目的:了解材料的体外降解能力及材料内生长因子的释放特点。 方法:体外将材料放置于缓冲液PBS中,连续12周观察材料体外降解能力;血小板中含有大量的生长因子,PDGF是重要的生长因子之一。通过ELISA检测了PDGF体外释放量及持续时间,反映材料体外释放情况。 结果:PBS/Platelet纳米纤维膜前3周代谢稍快,以后达到线性代谢模式,在12周末失重达到23.80%;单纯PBS纳米纤维降解缓慢,到12周末的失重率为5.20%。 在释放实验中,第1天PDGF释放最为明显,释放浓度达58.8%,有明显突释现象。第2周达66.1%;到第7周达72.4%。这说明负载血小板的PBS支架材料在最初的突释之后能维持局部的细胞因子浓度,具有一定的缓释作用。如何达到理想的控释,还需进一步研究。 3PBS纳米纤维膜和PBS/Platelet纤维膜对MG63增殖和分化的影响 目的:以人成骨样细胞MG63细胞为成骨细胞模型,评价支架材料对成骨细胞生物学特性的影响,了解材料在成骨方面的作用。 方法:MG63常规培养,接种于细胞培养板,通过材料溶血行为,支架材料表面细胞荧光染色,MTT、ALP活性等检测手段综合评价纳米纤维支架材料的溶血性及生物活性。 结果:支架材料溶血率为0.1475%,远远小于国家标准的5%,说明支架材料是安全的,无急性溶血活性。支架材料对成骨细胞增殖有一定的促进作用。 4PBS和PBS/Platelet纳米纤维膜对MG63成骨相关基因及蛋白的影响 目的:以人成骨样细胞MG63细胞为成骨细胞模型,探讨支架材料对成骨相关基因和蛋白表达的影响。 方法:MG63常规培养,接种于材料表面,分别于1、3、5天终止培养,消化细胞,提取RNA和蛋白。用Real-time PCR方法检测了Runx2,COL1α1,OPN基因的表达及并用Western Blot的方法检测OPN、SP7蛋白的表达水平。 结果:Real-time PCR结果显示,MG63细胞内Runx2基因的表达:第1天空白组明显高于PBS支架材料和PBS/Platelet支架组;第5天空白组的表达很低,PBS组和PBS/Platelet组的表达明显高于空白组,从第1天到第5天空白组的基因表达持续降低;MG63细胞内COL1α1基因的表达:第1、第3天表达量不高,组间无显著性差异,第5天空白组的表达明显高于第1、3天,PBS组和PBS/Platelet组的表达又明显高于空白支架组;MG63细胞内OPN基因的表达:在第1天空白组显著高于PBS组和PBS/Platelet支架组,第5天,PBS组和PBS/Platelet组的表达明显高于空白组。 Western Blot的检测结果显示:SP7的蛋白表达量,第1天组间无显著性差异;第3天及第5天PBS组及PBS/Platelet组显著高于空白组。第5天PBS/Platelet组显著高于PBS组。第1、3、5天空白组的表达呈下降趋势。 OPN的蛋白表达量,第1、3、5天,空白组的表达呈逐渐下降趋势。而PBS/Platelet组呈逐渐增高趋势。第1天PBS组表达最低,而PBS/Platelet组与其有显著性差异。第3天PBS组和PBS/Platelet组与空白组有显著性差异。第5天PBS组和PBS/Platelet组与空白组有显著性差异,PBS/Platelet组与PBS组有显著性差异。 综上所述,PBS在适当浓度和条件可制备成纳米纤维,并成功载入血小板血浆。PBS纳米纤维本身及PBS/Platelet纳米纤维对成骨细胞增殖有促进作用。可促进成骨相关基因及蛋白的表达。本研究为PBS作为骨支架材料进行初步探讨;为PRP及PRF的临床应用寻找更有效的方法。


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