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低剂量镉对肝脏组织远期影响的实验研究

王波  
【摘要】:镉是一种有毒的重金属,半衰期较长,主要蓄积在肝脏、肾脏等器官。流行病学和实验研究表明多种肿瘤与镉的职业暴露有关,包括肺脏、前列腺、肾脏、肝脏等,但具体机制未明。体外实验证实镉具有弱突变性,但并不能插入到DNA中,因此,推测镉致癌机理与表观遗传学密切相关。表观遗传学是指在基因组DNA序列不发生改变的情况下,基因表达发生改变并可以遗传的表型变化,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNAs及染色质重塑等。其中DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,属于共价化学修饰,主要发生在CpG。CpG寡核苷酸主要集中在基因组的某些特定区域,称为CpG岛。CpG岛通常位于基因启动子区,也可延伸至外显子,大小从500~5000bp不等。CpG岛对基因的表达起着调控作用,具有特殊的意义。大量研究证实基因组印记、X染色体的失活和许多肿瘤相关基因的失活都与基因启动子区CpG岛的甲基化有关。目前研究认为DNA甲基化与肿瘤密切相关。肿瘤的DNA甲基化表现为基因组整体甲基化水平降低与一些基因启动子区CpG岛的甲基化水平升高。CpG岛启动子区域甲基化的异常是肿瘤抑制基因和肿瘤相关基因失活的主要机制。 镉暴露主要通过影响表观遗传学修饰3个方面来改变基因表达:DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNAs (miRNAs)。研究表明镉暴露后可以引起整体DAN甲基化和特殊基因甲基化改变。镉诱导的整体DNA甲基化改变与恶性肿瘤的发生密切相关,并且一般伴随着甲基化转移酶的变化。特殊基因甲基化包括抑制原癌基因甲基化水平和诱导抑癌基因甲基化水平,进而导致肿瘤发生。 在以往镉对表观遗传学方面影响的研究中,主要以细胞和胚胎模型进行短期研究为主,未见镉暴露后长期观察的动物模型的实验研究。基于此,我们前期建立了低剂量镉暴露长期观察的动物模型。在镉组模型中52周时观察到持续病理改变并进一步应用蛋白组学方法发现肝脏蛋白表达异常,特别是具有抗氧化生物学活性的蛋白,提示低剂量镉暴露后大鼠肝脏组织抗氧化能力下降。在上面研究基础上,我们对该模型应用甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)结合启动子区及CpG岛芯片(Roche-NimbleGen,385K)高通量技术对该模型进行DNA甲基化基因进行筛选。根据标准,在符合条件的基因中,将镉组基因DNA启动子区甲基化状态大于对照组2倍作为高甲基化(hypermethylation),小于0.5倍作为低甲基化(hypomethylaiton)。启动子区CpG岛甲基化改变的基因共1,629个,其中高甲基化675个(41.44%),低甲基化899个(55.19%),55个(3.38%)基因部分高甲基化,部分低甲基化。随后对筛选出的基因进行生物信息学Gene Ontology(GO)分析,52周镉组差异甲基化基因中,高甲基化基因有25个GO队列;低甲基化基因有35个队列。结合前期观察到肝细胞凋亡减少的结果,针对与细胞死亡相关基因的GO队列进行分析,筛选出两个相关基因:CASP8基因高甲基化;TNF基因低甲基化。在大鼠模型中验证了两个筛选基因的表达情况。为进一步验证该结果,随后建立小鼠镉暴露模型,应用甲基化抑制剂5-aza作为阴性对照,在模型60周时,应用EpiTect Methyl qPCR检测系统验证CASP8基因启动子区域甲高基化,蛋白表达降低,与芯片结果一致。在Cd/5-aza组中,镉诱导的CASP8基因高甲基化能够被5-aza阻断。最后应用新发现的肝脏肿瘤标记物CK8/18对肝脏组织进行检测发现镉组肝脏组织发生了癌前病变,其他各种未见病变发生。 本研究通过建立低剂量镉暴露后长期观察的动物模型进行DNA甲基化芯片检测;应用生物信息学方法对差异甲基化基因进行筛选得到镉对肝脏组织影响DNA甲基化谱;在差异基因中发现凋亡相关的CASP8、TNF基因发生甲基化变化;并应用小鼠模型进行了验证。本研究明确了镉在诱导肿瘤发生过程中DNA甲基化参与肿瘤发生过程,为镉诱导肝脏肿瘤发生提供理论依据;同时也为镉诱导肿瘤发生机制研究提供了新思路。


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