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双酚A对乳腺癌细胞株GPR30-EGFR-STAT3信号通路的影响研究

张巍  
【摘要】:[研究目的] 双酚A是环境雌激素的一种,广泛存在于塑料制品,如食品容器、饮料瓶、牙齿填塞剂中,在我们的生活环境中大量存在并以消化和吸收的方式进入人体,很少量的双酚A就可以从聚合物中转移到食物或水中,特别在加热的时候。随着环境污染的日益加重,人类暴露在随时接触到双酚A的环境之中。目前有关双酚A诱导乳腺癌等雌激素依赖性肿瘤的发生机制还不清楚,其模拟雌激素的作用促进肿瘤细胞增殖的研究,主要集中在与肿瘤细胞增殖作用相关的雌激素受体、抗癌药耐药和对细胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2的影响。双酚A对雌激素依赖性肿瘤的信号传导通路的影响也少有报道,只有一项关于环境雌激素(EEs)激活卵巢癌中ERK1/2或p38与细胞增殖无关的研究。在导致乳腺癌的众多途径中,GPR30-EGFR-STAT3是非常重要的一条信号通路,本课题通过研究双酚A对乳腺癌细胞GPR30-EGFR-STAT3信号传导通路的影响,为研究双酚A诱导乳腺癌的确切机制提供依据。 [研究方法] 通过双酚A对雌激素受体阳性乳腺癌MCF-7和T47D细胞与雌激素受体阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞促增殖作用的对比反应研究,采用MTT法确定双酚A在促MCF-7和T47D细胞增殖作用中的最佳作用浓度和时间。通过Real-time PCR和Western blot实验技术研究在乳腺癌MCF-7细胞中,在双酚A作用的最佳浓度下GPR30、EGFR、STAT3三个基因随时间的表达情况,通过RNA干扰技术抑制STAT3和AG1478抑制EGFR来探讨EGFR-STAT3通路在双酚A诱导乳腺癌细胞增殖中的作用。 [研究结果] 1.通过浓度摸索确定双酚A诱导乳腺癌MCF-7和T47D细胞增殖作用最明显的时间和浓度,研究表明1μM的双酚A作用于MCF-7和T47D细胞24小时后表现出明显的促增殖作用,该增殖作用可以持续到48小时,双酚A作用48小时后细胞增殖最明显(P<0.05);双酚A分别作用24、48和72小时后,对MDA-MB-231细胞无明显促增殖作用。 2.综合Real-time PCR和Western blot的结果,STAT3和EGFR在1μM双酚A作用48小时后其诱导表达最明显(P<0.05);GPR30在双酚A作用48小时后其表达下调明显(P<0.05)。 3.通过EGFR的高选择性抑制剂AG1478对乳腺癌细胞中的EGFR进行阻断,当AG1478和双酚A协同作用时,乳腺癌MCF-7和T47D细胞的增殖相对于双酚A单独作用组无明显区别,经统计学处理其组间无显著性差异(P>0.05)。 4.AG1478抑制MCF-7细胞中的EGFR后,STAT3蛋白的表达受到显著抑制(P<0.05)。 5.通过转染筛选STAT3siRNA片段,STAT3siRNA5干扰片段能够显著抑制STAT3基因的表达(P<0.05)。通过对照研究发现,当STAT3siRNA5干扰了乳腺癌细胞中的STAT3基因表达后,双酚A未能使抑制了STAT3的MCF-7和T47D细胞发生增殖效应,经统计学处理其组间无显著性差异(P>0.05)。 [研究结论] 1.进一步证实了双酚A在雌激素依赖性肿瘤乳腺癌细胞中的增殖作用,确定了双酚A对乳腺癌细胞的最佳增殖作用浓度和作用时间点分别是1μM和48小时。 2.在双酚A所诱导的乳腺癌MCF-7细胞的增殖作用中,EGFR-STAT3通路被有效的激活,表现为EGFR-STAT3通路在双酚A作用48小时后表达明显增强,但GPR30表达在双酚A作用48小时后减弱,机制为双酚A结合GPR30后分解GPR30蛋白并向EGFR-STAT3传递信号进而激活该通路。 3.在EGFR被抑制后双酚A仍能使乳腺癌细胞显著增殖,说明EGFR不是双酚A促细胞增殖的必经通路,双酚A可能通过其他通路或直接作用于STAT3发挥促细胞增殖作用。 4.EGFR-STAT3是联系非常紧密的通路,抑制EGFR后STAT3下调明显,但对双酚A诱导细胞增殖无直接影响,双酚A可以不通过EGFR通路激活未被抑制的STAT3诱导乳腺癌细胞的增殖。 5.STAT3在双酚A所诱导的细胞增殖中起重要作用,是双酚A促肿瘤细胞增殖作用中非常重要而关键的环节之一。 6.GPR30-EGFR-STAT3是乳腺癌中非常重要的信号传导通路,双酚A在这三个环节中都发挥了重要作用,但双酚A对STAT3的作用最为重要,即使通过抑制EGFR来下调STAT3基因的表达,双酚A仍能作用于残留的STAT3发挥促肿瘤细胞的增殖作用。


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