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靶向肿瘤重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL的表达、纯化及其生物活性的研究

郭德军  
【摘要】:肿瘤疾病已成为人类的第一杀手,对于恶性肿瘤目前还缺少较为理想的药物,利用细胞因子及其受体介导杀伤癌细胞是癌症靶向治疗的一个策略。根据IL-6R在一些肿瘤细胞表面过表达,而正常细胞表面数量极少表达或不表达的事实,我们利用基因工程原理和分子生物学技术,将截短的IL6的基因与绿脓杆菌外毒素变体PE38KDEL的基因相偶联,构建了重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL的原核表达载体和酵母表达载体,并分别在大肠杆菌和毕赤酵母中实现了重组毒素的活性表达;同时初步建立了该重组毒素的纯化工艺,其体外和体内抗肿瘤生物学活性表明,重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL在体内和体外具有明显的靶向抗肿瘤活性,为其进一步开发提供技术和理论支持。 重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL的构建与表达。利用PCR技术,将N端截去23个氨基酸的IL6基因与改造的绿脓杆菌外毒素PE38KDEL基因相连接,成功构建了重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL的基因。然后将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a和pET-22b上,构建了大肠杆菌表达质粒28a-IL6_(T23)-PE38KDEL和22b-IL6_(T23)-PE38KDEL,重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,可溶性表达的重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL具有选择性细胞毒;28a-IL6_(T23)-PE38KDEL表达量高于22b-IL6_(T23)-PE38KDEL,28℃表达时可溶性重组毒素占可溶蛋白总量的12.9%。28a-IL6_(T23)-PE38KDEL在改良ZYM-5052培养基中可实现高密度自诱导表达,菌体密度与IPTG诱导的LB培养基相比,可提高4倍,目的蛋白占菌体上清蛋白总量的11.7%,这为利用醇溶性单抗纯化该重组蛋白奠定了基础。成功构建了巨大芽胞杆菌pHis-IL6_(T23)-PE38KDEL重组质粒,但重组巨大芽胞杆菌在培养基中分泌表达的重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL无细胞活性。利用密码子优化的IL6_(T23)-PE38KDEL基因,成功构建了甲醇酵母pPICZ-IL6_(T23)-PE38KDEL重组质粒,并在毕赤酵母GS115中获得分泌性表达,表达产物具有选择性细胞活性,但表达量较低。 重组毒素的纯化。利用包涵体复性技术和层析技术,建立了利用大肠杆菌制备重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL的纯化工艺。大肠杆菌表达的重组毒素的包涵体,经洗涤、复性、Q Bio-sep HP和MonoQ层析和多粘菌素B除内毒素等步骤,制备了高纯度、具有细胞活性的重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL,为体外和体内抗肿瘤试验奠定了基础。 重组毒素的体外抗肿瘤活性。初步建立了重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL体外抗肿瘤谱;IL6_(T23)-PE38KDEL可特异性杀伤骨髓瘤细胞、髓系白血病细胞、肝癌细胞,而对其他供试细胞无效,并使用MTT法测定了敏感细胞的半致死剂量;重组毒素的半致死剂量在同系细胞间表现为明显的IL6R数量依赖关系,非同系细胞间无受体数量依赖关系。IL6_(T23)-PE38KDEL与IL6R受体的结合时间在15~30min之间。IL6可竞争阻断IL6_(T23)-PE38KDEL的细胞毒性,当IL6浓度达到IL6_(T23)-PE38KDEL二倍以上时,其阻断效果明显增加。 重组毒素的体内抗肿瘤活性。在小鼠腹腔瘤模型的静脉给药治疗试验中,重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL在体内表现出明显的抗肿瘤效应,能明显延长荷瘤鼠的生存期;高剂量组与对照组相比延长荷瘤鼠的生存期6.6d,肿瘤完全消退率为30%,治疗效果在组间表现出明显的剂量依赖关系。在小鼠腹腔瘤模型的腹腔给药治疗试验中,介入给药表现为强烈的抗肿瘤效果,肿瘤完全消退率为70%,有效率为100%,肿瘤转移抑制率100%。重组毒素IL6_(T23)-PE38KDEL在体内具有明显的抗肿瘤效应,毒副作用低,对其他实质性脏器未见明显损伤,仅表现为转氨酶轻度升高和红细胞数略微下降,可能成为一个潜在的抗肿瘤候选药物。


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