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拟人参皂苷Rh2诱导人胃癌细胞SGC凋亡作用及其研究机制

曲相如  
【摘要】:研究背景: 人参是我国传统的中药材,具有广泛的药理作用。人参皂苷是人参的主要有效成分,对多种肿瘤细胞具有广谱的抗肿瘤作用。本文通过对拟人参皂苷Rh2抗肿瘤作用的检测,发现拟人参皂苷Rh2对多种人源性肿瘤细胞具有增殖抑制作用,其中对人胃癌细胞SGC最为敏感,可显著抑制SGC细胞的增殖,作用于SGC细胞24h时检测其IC50为32.9μg/mL,且其抑制SGC细胞增殖的作用呈剂量和时间依赖性。但拟人参皂苷Rh2通过何种机制抑制SGC细胞的增殖目前尚不清楚。本研究采用了分子生物学手段对祖国传统中药进行研究,弘扬祖国的传统医学,开发出新的抗肿瘤药物。在此前提下,深入探讨拟人参皂苷Rh2的抗肿瘤作用机制,是一项具有研究价值和研究前景的课题。 研究目的: 拟人参皂苷Rh2能否在体外诱导人胃癌细胞SGC凋亡及其作用机制。 研究方法: 1、MTT法检测拟人参皂苷Rh2对SGC细胞的增殖抑制作用及IC50值。 2、采用荧光倒置显微镜检测Hoechst33342和AO/EB染色后拟人参皂苷Rh2诱导SGC细胞发生凋亡的形态学变化。 3、采用流式细胞仪检测拟人参皂苷Rh2诱导SGC细胞凋亡的比例及拟人参皂苷Rh2对线粒体膜电位和活性氧的影响。 4、分光光度法检测拟人参皂苷Rh2对Caspase-3,-9的活性含量的影响。 5、免疫印迹法检测拟人参皂苷Rh2对CytC、AIF、Smac、Bcl-2、Bax、caspase-3,-9、PARP等蛋白表达及分布的影响。 6、免疫印迹法检测拟人参皂苷Rh2对PI3K/AKT通路和MAPK通路的影响。 研究结果 1拟人参皂苷Rh2对肿瘤细胞增殖抑制作用 1.1MTT法检测拟人参皂苷Rh2对人胃癌细胞SGC、人非小细胞肺癌A549、人成纤维肉瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓原性白血病细胞K562、人黑色素瘤细胞A375、人乳腺癌细胞MCF-7、人急性髓性白血病细胞HL-60细胞、人肝癌细胞(SMMC)、人卵巢癌细胞(SK-OV-3)增殖的影响。不同剂量的拟人参皂苷Rh2(5,10,20,40和80μg/mL)作用于24h后发现,拟人参皂苷Rh2对以上肿瘤细胞均有抑制作用,且对人胃癌细胞SGC最为敏感,呈剂量和时间依赖性。 1.2拟人参皂苷Rh2对肿瘤细胞的抑制作用优于人参皂苷Rh2 2.拟人参皂苷Rh2诱导SGC细胞凋亡作用的研究 2.1形态学检测 2.1.1Hoechst33342染色 不同浓度的拟人参皂苷Rh2作用SGC细胞24h后,荧光倒置显微镜下观察。Hoechst33342染色后,正常细胞的细胞核呈圆形,淡蓝色。而经拟人参皂苷作用后,镜下可见到染色质边集的细胞不断增加、凝集,有典型的“凋亡小体”出现。此作用呈剂量依赖性。 2.1.2AO/EB染色 不同浓度的拟人参皂苷Rh2作用于SGC细胞24h后,荧光倒置显微镜下观察可见随着拟人参皂苷Rh2浓度逐渐增加,细胞皱缩,体积缩小,细胞膜粗糙,细胞呈现黄绿色荧光。 2.2流式细胞仪检测细胞凋亡 FITC-AnnexinV/PI双染色不同浓度的拟人参皂苷Rh2作用于SGC细胞24h后,各剂量组与对照组比较均观察到明显的细胞凋亡,呈剂量依赖性。以上实验结果显示,拟人参皂苷Rh2可诱导SGC细胞发生凋亡。 3拟人参皂苷Rh2诱导SGC细胞凋亡分子机制研究 3.1拟人参皂苷Rh2对线粒体功能的影响 3.1.1拟人参皂苷Rh2对线粒体膜电位的影响 不同浓度的拟人参皂苷Rh2作用SGC细胞24h后,可明显诱导SGC细胞线粒体膜电位的降低,并且随着剂量的逐渐增加而降低,与对照组比较差异显著,呈剂量依赖性。提示,拟人参皂苷Rh2诱导SGC凋亡可能是通过改变线粒体的通透性实现的。 3.1.2拟人参皂苷Rh2对Bcl-2和Bax的影响 拟人参皂苷Rh2可以下调Bcl-2的蛋白表达,上调Bax/Bcl-2的比率,呈剂量依赖性。提示,拟人参皂苷Rh2可通过改变Bax/Bcl-2的比率,促使线粒体膜电位降低,从而诱导细胞凋亡。 3.1.3拟人参皂苷Rh2对Cyt C,AIF和Smac表达的影响 拟人参皂苷Rh2可明显促进线粒体内的Cyt C,AIF和Smac向细胞质释放,呈剂量依赖性。 3.1.4拟人参皂苷Rh2对Caspase-3,-9及PARP蛋白表达及活性的影响 拟人参皂苷Rh2可明显上调Caspase-3,-9的活性,并可顺序化激活Caspase家族和PARP的剪切活化。 以上结果说明,拟人参皂苷Rh2依赖线粒体途径诱导SGC细胞凋亡。拟人参皂苷Rh2可以通过上调Bax/Bcl-2的比率,促使线粒体膜电位下降,释放Cyt C,AIF和Smac等促凋亡因子,激活Caspase蛋白家族,从而诱导细胞凋亡。 3.1.5拟人参皂苷Rh2对活性氧的影响 不同浓度的拟人参皂苷Rh2作用SGC细胞24h后,可明显上调活性氧的产生,呈剂量依赖性,与对照组比较有明显差异。提示拟人参皂苷Rh2在诱导细胞凋亡的过程中伴有活性氧的产生。 3.2拟人参皂苷Rh2对PI3K/AKT通路的影响 拟人参皂苷Rh2可明显抑制AKT的磷酸化,呈剂量依赖性。提示,拟人参皂苷Rh2诱导细胞凋亡的过程中有PI3K/AKT通路的参与。 3.3拟人参皂苷Rh2对MAPK通路的影响 拟人参皂苷Rh2可明显增加ERK磷酸化,呈剂量依赖性。提示,拟人参皂苷Rh2诱导细胞凋亡的过程中有MAPK通路的参与。 结论: 1.拟人参皂苷Rh2可明显抑制SGC细胞增殖,呈时间和剂量依赖性; 2.拟人参皂苷Rh2可诱导SGC细胞凋亡; 3.拟人参皂苷Rh2可通过线粒体途径诱导细胞凋亡; 4.拟人参皂苷Rh2诱导凋亡过程中有活性氧的产生; 5.拟人参皂苷Rh2诱导细胞过程中有PI3K/AKT通路、MAPK通路的参与。


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