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含硒谷胱甘肽硫转移酶的真核表达及抗氧化作用研究

尹俐  
【摘要】:天然GPX(GPX;EC1.11.1.9)的一个重要特性是能识别和结合GSH,并以此为基础发挥抗氧化活性。然而,天然GPX来源有限、分子量较大、稳定性差,这些缺陷极大地限制了其在药学领域的应用,因此,研究者采取多种方法人工模拟GPX。 GPX的人工模拟主要基于GPX的两个酶学特点:在空间位置中靠近GSH的独特的催化官能团,以及能够识别并结合谷胱甘肽(GSH)。前期研究主要是以小分子为基础引入催化官能团Se,但由于对底物GSH结合位点的忽视,制备的大多数GPX人工模拟物酶活力不高。基于此,研究者便寻找能结合GSH的分子,并以此为基础进行了一些化学修饰或基因工程改造以求获得GPX活力较高的模拟物。人Zeta族谷胱甘肽硫转移酶(hGSTZ1-1)具有天然的GSH结合位点,而且活性中心包含三个高度保守的残基(Ser14,Ser15和Cys16),且Ser14,Ser15和Cys16在空间位置上靠近GSH的巯基,并且其结构稳定性较高,意味着hGSTZ1-1可作为GPX模拟物的理想骨架。研究者以hGSTZ1-1为蛋白骨架,进行化学修饰将Ser修饰为Sec获得了具有较高GPX活力的Se-hGSTZ1-1,取得了突破性的进展,然而由于蛋白中存在大量丝氨酸,因此对于确定哪些位置的丝氨酸被化学修饰为Sec存在一些困难,这对于进一步研究GPX模拟酶的结构和功能带来很大不确定性。本文用基因工程的方法构建了Seleno-hGSTZ1-1(Ser15Sec)分泌型真核细胞表达载体,并通过HEK293T细胞成功表达,经过活性检测,发现Seleno-hGSTZ1-1(Ser15Sec)表现出较高的GPX活性。并且,在细胞水平上对Se-hGSTZ1-1的抗氧化作用进行了初步探索。主要开展了以下工作: 1.含硒谷胱甘肽硫转移酶的表达与纯化 利用本课题组已构建好的含有hGST Z1-1基因的硒蛋白真核表达载体和快速定点突变法,将与底物GSH结合部位中编码15位Ser的基因替换成由UGA编码的催化官能团Sec,在其N-末端含有六个组氨酸标签以方便检测及纯化。将含有突变后的靶基因的质粒克隆扩增,获得突变质粒。再将质粒转染HEK293T细胞并在细胞培养液中添加无机硒以促进重组硒蛋白的表达。应用Ni2+螯合亲和层析(IMAC)纯化可溶性表达的重组含硒蛋白Seleno-hGSTZ1-1(Ser15Sec)。应用western blot实验鉴定表达和纯化的重组含硒蛋白。 2.对重组硒蛋白的GPX活性及动力学研究 通过对重组含硒蛋白Seleno-hGSTZ1-1(Ser15Sec)的GPX活力检测发现,Seleno-hGSTZ1-1(Ser15Sec)的GPX活性为2266±308U/μmol。通过动力学分析发现Seleno-hGSTZ1-1(Ser15Sec)对GSH的亲和力较高。通过同源建模的方法对Seleno-hGSTZ1-1(Ser15Sec)及Se-hGSTZ1-1的结构进行对比,探索性地分析了Seleno-hGSTZ1-1(Ser15Sec)与天然GPX活力差异以及Seleno-hGSTZ1-1(Ser15Sec)与Se-hGSTZ1-1活力差异的原因。 3.在细胞水平研究含硒谷胱甘肽硫转移酶的抗氧化作用 利用H_2O_2损伤大鼠心肌细胞建立制造氧化应激模型,分别采用预给药和造模后给药两种给药方式对Se-hGSTZ1-1的抗氧化作用进行研究。通过运用丙二醛(MDA)测定试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、SOD检测试剂盒及流式细胞仪检测发现,含硒谷胱甘肽硫转移酶能增加心肌细胞存活率,减少脂质过氧化产物MDA的生成,降低由细胞膜完整性被破坏而引起的LDH泄漏,降低细胞内SOD含量。通过western blot对细胞PPAR-γ、NF-κB、bcl-2和bax含量的检测发现,Se-hGSTZ1-1能逆转H_2O_2引起的心肌细胞PPAR-γ和bcl-2的低表达及NF-κB和bax的高表达,表明,Se-hGSTZ1-1在对抗H_2O_2损伤大鼠心肌细胞的过程中,能调节PPAR-γ、NF-kB、bcl-2和bax的表达,并使其趋于正常表达状态。 本研究成功制备了具有2266±308U/μmol GPX活力的重组硒蛋白Seleno-hGSTZ1-1(Ser15Sec)。体外抗氧化研究发现,含硒谷胱甘肽硫转移酶可以在细胞水平发挥与天然GPX类似的抗氧化功能。


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