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乙型肝炎肝硬化患者骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化为肝细胞样细胞的实验研究

范宝晶  
【摘要】:骨髓中主要包含造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs),间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和血管内皮前体细胞,近年研究表明还包含其它干细胞群,如生肌多能成体祖细胞(Multipotent adultprogenitor cells,MACP)。可以从不同组织分离的得到具有相似的生物学特性的间充质干细胞,包括脂肪组织,骨骼肌,胎儿肝脏和胰腺,脐血和羊水等。在适当的培养条件下MSCs具有自我更新和多向分化潜能,如:成骨细胞,心肌细胞,脂肪细胞,少突胶质细胞和神经元细胞等。同时MSCs具有抗增殖、抗炎活性、低免疫反应等特性,使其可以安全用于自体或异体移植,MSCs容易转染和易于冷冻保存。骨髓MSCs在细胞和组织工程中发挥重要作用,近年来在基础研究和临床实践骨髓来源的MSCs已引起人们极大的兴趣。 乙型肝炎是全世界最常见的传染病之一。全世界大约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者。乙型肝炎的治疗是非常有限的,而且HBV感染可能会导致肝硬化和肝癌。慢性肝损伤,肝细胞的再生能力丧失,从而导致肝脏无法维持其功能,这就是临床上所谓的“肝功能衰竭”。目前,原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT),被认为是最适合肝功能衰竭患者的治疗方法。细胞治疗可能是OLT最好的替代治疗方法。干细胞移植可促进肝脏的再生和自我修复,为肝脏再生提供了重要的理论和方法。MSCs容易获得和进行大量的体外扩增培养,无伦理学限制和免疫排斥反应,研究表明MSCs为肝干细胞疗法的理想种子细胞。一些研究已经证明MSCs可分化为肝细胞系细胞,动物实验研究结果亦显示,通过脾脏或静脉途径的移植MSCs,植入的MSCs可以在受者肝脏并分化为有功能的肝细胞。一些自体骨髓MSCs移植临床试验已进行,初步结果认为骨髓MSCs移植对治疗肝脏疾病是可行和安全的,然而对乙型肝炎肝硬化患者的自体骨髓MSCs移植的疗效尚存在不同观点。乙肝病毒感染是否会影响移植的干细胞功能仍是未知。迄今为止,关于乙型肝炎肝硬化患者骨髓间充质干细胞的生物学特性和肝细胞系分化潜能尚不完全清楚。 本研究旨在建立乙型肝炎肝硬化患者骨髓MSCs体外培养体系,探讨其生物学特性,并与健康供者的骨髓来源MSCs的生物学特性进行比较,同时采用肝细胞诱导培养基和肝硬化患者自体血清诱导培养骨髓MSCs,并在基因、蛋白水平检测肝细胞系特异性标志物AFP、ALB和CK-18表达,探讨乙型肝炎肝硬化患者骨髓MSCs向肝细胞分化潜能和对HBV易感性,为MSCs向肝细胞分化选择最适微环境,为临床应用自体骨髓MSCs治疗终末期肝病提供实验基础和理论依据。 本研究采用密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离培养乙型肝炎肝硬化患者和健康供者骨髓MSCs,观察两者骨髓MSCs的培养成功率、原代培养时间,测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面标记,定向诱导骨髓MSCs向成骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞分化,免疫组织化学染色和荧光定量PCR检测肝硬化患者骨髓MSCs乙肝病毒表面标志物和HBVDNA表达;肝细胞诱导培养基和肝硬化患者自体血清诱导培养骨髓MSCs,相差显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测肝细胞系特异性标志物AFP、ALB和CK-18表达,过碘酸雪夫试剂染色检测细胞糖原合成功能,RT-PCR技术检测ALBmRNA表达。结果如下: 1.淋巴细胞分离液离心获得比较均一的单个核细胞,培养48h部分细胞已经贴壁并分裂增殖。肝硬化患者和健康供者骨髓MSCs的体外分离培养成功率分别为73.33%(11/15)和100%(11/11);两组骨髓MSCs的原代培养时间分别为(16.0±1.8)天和(12.0±1.5)天,差异有统计学意义(P<0.05);两组骨髓MSCs具有相似的形态,均呈梭形,成纤维细胞样细胞;肝硬化患者骨髓MSCs生长缓慢,容易蔓延和老化。 流式细胞仪检测结果表明,两组骨髓MSCs大部分细胞处于相对不活跃的静止期,只有小部分处于活跃的增殖状态,肝硬化患者骨髓MSCs的S期细胞比例为(4.58±0.96)%,而供者骨髓MSCs的S期细胞比例为(7.58±1.24)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。肝硬化患者和健康供者第五代骨髓MSCs高表达特征性表面标志CD44、CD29、CD105和CD166,不表达造血干细胞的表面标志CD34。肝硬化患者和健康供者骨髓MSCs具有向成骨细胞、脂肪细胞和神经元细胞分化的潜能。肝硬化患者第1、3和5代骨髓MSCs的HBsAg、HBcAg免疫组织化学染色和HBVDNA检测结果均为阴性。 2.肝细胞诱导培养基诱导培养肝硬化患者骨髓MSCs, MSCs形态发生明显改变,变得大而扁平,呈类上皮样细胞,对照组细胞形态无改变;对照组细胞无ALB, CK-18和AFP表达,诱导组诱导培养7、14和21天,AFP阳性率分别为(55.6±9.3)%,(20.8±5.2)%和(7.5±1.2)%,与对照组比较差异有统计学意义(p 0.05);ALB阳性率分别为(12.8±4.2)%,(40.5±7.6)%和(70.5±10.9.)%,与对照组比较差异有统计学意义(p 0.05);CK-18阳性率分别为(10.6±3.8)%,(50.4±9.3)%和(81.2±12.3)%,与对照组比较差异有统计学意义(p 0.05);肝细胞诱导培养基可诱导骨髓MSCs表达AFP、ALB和CK-18,AFP表达随着诱导培养时间的延长减少,ALB和CK-18的表达随着诱导培养时间的延长逐渐增加;肝细胞诱导培养基诱导肝硬化患者骨髓MSCs具有肝细胞特有的糖原合成功能,表达ALBmRNA。 3.6例肝硬化患者均为男性,血清HBVDNA含量6.56E+4~7.52E+8,ALT、CHE、ALB、TBIL异常,肝硬化患者骨髓MSCs在含20%自体血清的低糖DMEM培养基中培养,生长状态良好,呈类上皮样;自体血清诱导培养7、14和21天,骨髓MSCs表达ALB,CK-18和AFP, AFP表达随着诱导培养时间的延长减少,ALB和CK-18的表达随着诱导培养时间的延长逐渐增加;自体血清诱导骨髓MSCs具有肝细胞特有的糖原合成功能,表达ALBmRNA;乙型肝炎肝硬化患者自体血清体外培养的骨髓MSCs未感染HBV。 综上研究表明,密度梯度离心法结合贴壁培养法可以分离培养到大量、高活性、纯度的骨髓MSCs,乙型肝炎肝硬化患者骨髓MSCs在体外培养成功率明显低于健康供者,且MSCs生长速度慢,原代培养时间长,但肝硬化骨髓MSCs未感染HBV,其与健康供者骨髓MSCs具有相同的表面标志和分化潜能;肝细胞诱导培养基和肝硬化患者自体血清可以诱导肝硬化患者骨髓MSCs分化为肝细胞样细胞,表达肝细胞系特异性标记物ALB、AFP和CK-18和ALB mRNA,具有糖原合成功能。但不同肝硬化患者自体血清诱导骨髓MSCs表达肝细胞系特异性标记的阳性率并不相同,血清生化指标改变不明显的2例肝硬化患者诱导培养后,MSCs的AFP、ALB和CK-18表达水平较低,糖原合成功能亦较低,推测可能与肝硬化患者血清的细胞因子水平有关,就此方面还需作更深入的研究,以建立更适合骨髓MSCs向肝细胞分化的微环境。 本研究的创新点是系统评价乙型肝炎肝硬化患者骨髓MSCs的生物学特性,探讨其向肝细胞系定向分化潜能,采用肝硬化患者自体血清诱导培养骨髓MSCs,探讨其对MSCs的诱导分化作用,为肝硬化患者应用自体骨髓MSCs移植治疗提供了实验基础和理论依据。


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