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人参皂甙Rb1调节AQP4表达在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中作用的实验研究

黄飞  
【摘要】:脊髓缺血再灌注损伤(Spinal cord ischemia-reperfusion injury, SCII)一直是神经科学研究的难点之一,SCII是指在某种损伤因素作用下脊髓经过一定时间缺血后得到血液再灌注后出现明显的功能障碍,甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象。脊髓缺血再灌注的主要损伤因素在于再灌注后的继发性损伤,决定了脊髓缺血再灌注损伤的预后。继发损伤的发病机制主要涉及脊髓水肿、神经细胞凋亡等机制,因此保护脊髓神经元,避免脊髓水肿,是治疗脊髓缺血再灌注损伤的关键所在。 水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)广泛分布于脊髓之中,特异性介导水分子的双向转运,对维持细胞内外渗透压起着关键的作用。脊髓缺血再灌注损伤的具体发病机制虽不清楚,但早期脊髓组织水肿是得到广泛公认的病理改变,因此推测水通道蛋白4在脊髓缺血再灌注损伤中表达异常,而调控水通道蛋白4表达无疑有希望成为治疗脊髓缺血再灌注损伤的新型特异性靶点。 人参作为一种名贵的中药,药性温和,药理作用广泛,其作为药物使用已有近3500年的历史。人参具有免疫调节、抗衰老、抗氧化、减少细胞凋亡、保护神经等作用。其发挥功效的主要成分之一是人参皂甙,人参皂甙是从人参在地表以上部分的茎叶中提取的有效成分,目前已提纯的单体成分有50多种。近年来,我国学者尝试将人参皂甙用于治疗神经系统疾病及神经损伤,已取得一定疗效,但人参皂甙对中枢神经系统的保护作用机制尚不清楚,缺乏系统深入的研究。在众多的人参皂甙单体中,人参皂甙单体Rb1具有显著的神经修复,抗氧化,清除氧自由基,减少细胞凋亡等效应,而脊髓缺血再灌注损伤中也涉及上述损伤机制,因此推测人参皂甙Rb1可能在脊髓缺血再灌注损伤中发挥重要治疗效应。 本研究拟通过建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型,应用The Basso BeattieBresnahan(BBB)评分系统评价脊髓神经功能;HE染色,尼氏体染色,Tunel凋亡检测等方法明确神经细胞形态变化及凋亡情况;应用免疫荧光,western blot,Real-time PCR等手段检测水通道蛋白4的表达情况。同时给予人参皂甙Rb1干预,观察人参皂甙Rb1干预对上述观测指标的影响,明确AQP4、人参皂甙Rb1和SCII三者间的作用及其可能机制,为临床研发新型治疗SCII的药物提供理论基础。 1.人参皂甙Rb1对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的干预作用目的:明确人参皂甙Rb1对SCII的治疗作用,寻找适宜治疗剂量方法:SD大鼠120只,随机分为空白对照组,脊髓缺血再灌注组,人参皂甙5mg/kg·d治疗组,人参皂甙10mg/kg·d治疗组,人参皂甙治20mg/kg·d治疗组。采用腹主动脉夹闭法建立SCII模型,不同组别给予相应剂量的人参皂甙Rb1腹腔注射。给予腹腔注射人参皂甙后即刻记为0点,24小时后记为1d,分别在1d、3d、5d和7d四个时间点处死大鼠,采用BBB评分系统评价神经功能,HE染色观察病理组织结构和细胞形态改变,Tunel方法检测细胞凋亡情况。结果:脊髓缺血再灌注组,人参皂甙Rb15mg/kg·d治疗组,人参皂甙Rb110mg/kg·d治疗组,人参皂甙Rb120mg/kg·d治疗组均不同程度存在后肢功能障碍。人参皂甙Rb110mg/kg·d治疗组的BBB评分在1d后明显优于脊髓缺血再灌注组(P<0.05)和人参皂甙Rb15mg/kg·d治疗组(P<0.05);但与人参皂甙Rb120mg/kg·d治疗组的BBB评分无显著差异(P>0.05)。HE染色显示脊髓缺血再灌注组部分神经元受损,一些神经元胞体膨大,结构不清,可见细胞胞核固缩,组织间充血。人参皂甙Rb15mg/kg·d治疗组,人参皂甙Rb110mg/kg·d治疗组,人参皂甙Rb120mg/kg·d治疗组的镜下病理组织结构和细胞形态与脊髓缺血再灌注组比较均有一定的改善。Tunel检测显示空白对照组很少有细胞凋亡,脊髓缺血再灌注组的神经细胞凋亡率较高。在3d,5d和7d三个时间点,脊髓缺血再灌注组的细胞凋亡率较空白组细胞显著增高(P<0.05);与脊髓缺血再灌注组相比,不同剂量的人参皂甙Rb1干预均会显著减少细胞凋亡(P<0.05);人参皂甙Rb15mg/kg·d治疗组的细胞凋亡率显著高于人参皂甙Rb110mg/kg·d治疗组(P<0.05);但是给予人参皂甙Rb110mg/kg·d和20mg/kg·d比较,细胞凋亡率没有显著性差异(P﹥0.05)。结论:人参皂甙Rb1对大鼠SCII有治疗作用,适宜剂量为10mg/kg·d。 2.水通道蛋白4在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的动态表达变化目的:探讨水通道蛋白4在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的作用方法:SD大鼠72只随机分为空白组,假手术组和SCII组,每组24只。建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型,并于1d、3d、5d、7d四个时间点分别处死6只。BBB评分评价神经功能,Western blot和免疫荧光方法检测AQP4的表达情况。结果:空白对照组和假手术组在不同时间点的BBB评分均为21分,SCII组的BBB评分在1d时最低,随时间推移逐渐增加,3d明显优于1d(P<0.05),5d明显优于3d(P<0.05),5d明显优于7d(P<0.05)。Western blot在34KD及43KD分子量处可见特异性条带,SCII组早期AQP4的表达水平显著下降,即在1d、3d、5d、7d四个时间点AQP4的表达显著低于空白对照组和假手术组,但呈逐渐增加趋势;但在7d仍显著低于正常空白组和假手术组(P<0.05)。免疫荧光检测AQP4的表达变化趋势与Western blot的检测结果相似。结论:SCII会导致AQP4低表达,这可能是造成SCII神经功能障碍的重要原因。 3.人参皂甙Rb1通过调控AQP4环节治疗脊髓缺血再灌注损伤的机制研究目的:探讨人参皂甙Rb1对SCII大鼠AQP4表达的调控作用方法:SD大鼠96只,随机分为正常组,假手术组,SCII组和人参皂甙Rb1治疗组,每组24只。建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型,治疗组每日给予腹腔注射人参皂甙Rb110mg/kg·d。所有组别分别在1d、3d、5d、7d四个时间点处死6只大鼠。BBB评分系统评价神经功能。HE染色、尼氏体染色检测脊髓组织结构和细胞形态变化,Tunel方法检测细胞凋亡情况。分别采用Western blot、real timePCR和免疫荧光法检测AQP4的蛋白和mRNA表达变化。 结果:与SCII对照组比较,人参皂甙Rb1治疗可显著增加大鼠BBB评分,改善神经细胞形态,减少细胞凋亡。人参皂甙Rb1可以显著增加SCII模型的AQP4蛋白和mRNA表达,并且在人参皂甙Rb1干预7d后AQP4蛋白和mRNA表达水平恢复至正常水平,与空白对照组比较无显著差异(P﹥0.05)。 结论:人参皂甙Rb1对大鼠SCII具有治疗效果,其作用机制可能是上调AQP4表达,减少神经水肿及细胞凋亡。


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