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灵芝多糖逆转顺铂耐药卵巢癌细胞作用及其机制研究

曲红光  
【摘要】:卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤之一,临床上一般采用手术、化疗的综合治疗方案。然而由于卵巢特殊的解剖位置,其位于盆腔深部,故患者出现症状并确诊时,多数已经是卵巢癌晚期,错失了手术治疗的最佳时机。因此卵巢癌的发病往往是致命的。临床上对于中晚期卵巢癌患者主要采取手术联合化疗缓解病情,目前,绝大多数患者虽然经过规范、足疗程的化疗,但是患者的5年生存率仍然较低,原因在于卵巢癌细胞对长期使用以顺铂为基础的一线化疗药物,产生耐药,是最终导致卵巢癌复发和化疗失败的最主要原因,无法挽救患者生命。尽管目前已采用多种化疗药物联合配伍、加大用药剂量等策略应对肿瘤细胞耐药的发生,但随之而来的毒副作用增大,加重患者机体功能的衰竭,削减了机体自身的免疫调节作用,最终造成肿瘤的扩散和蔓延而严重影响了化疗效果。现阶段公认的卵巢癌耐药机制主要包括:P糖蛋白介导的药物外排、DNA损伤修复能力增强、抗凋亡能力增强等。鉴于此,针对肿瘤耐药的特异性机制,寻找新型药物,逆转肿瘤细胞耐药,提高抗肿瘤药物的治疗效果,必将成为一种重要的抗肿瘤辅助治疗手段。灵芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharides,GLP)是一种具有多种药理活性的多糖,是灵芝发挥作用的主要成分。有研究表明,GLP的药理作用主要集中在抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒及免疫调节等方面,并已用于临床一些疾病的辅助治疗,如癌症、慢性病、老年病等,以及用于提高患者的免疫力。随着肿瘤发病率的日益增加,抗肿瘤药物的研究一直被广为重视,GLP在抗肿瘤方面的作用也成为研究的热点之一,鉴于GLP具有多种生物活性和良好的生物安全性,将其作为辅助药物与一线化疗药物联合用于肿瘤耐药的治疗,通过配伍联合应用,以期增加化疗药物的疗效,改善卵巢癌患者化疗耐药的有益尝试。迄今为止,应用GLP逆转卵巢癌细胞耐药的研究尚未见报道。本研究选用GLP作为研究对象,尝试将GLP和DDP联合应用,研究其对DDP耐药卵巢癌细胞株SKOV-3/DDP的逆转作用,并初步探讨了其可能的作用机制,以期为GLP在临床耐药肿瘤治疗中的应用,提供理论支持和实验依据。研究首先采用DDP梯度递增法反复间歇给药,诱导构建了人卵巢癌SKOV-3细胞系的DDP耐药细胞株,命名为SKOV-3/DDP。以SKOV-3/DDP细胞为研究对象,检测GLP和DDP联合应用对SKOV-3/DDP细胞耐药基因GSTs的影响,并且探讨GLP和DDP对SKOV-3/DDP细胞增殖、分化、凋亡、迁移侵袭能力和对DDP耐药性的作用及其机制;并应用超低吸附法诱导SKOV-3/DDP肿瘤球,模拟体内癌细胞生存及迁移模式,通过建立卵巢癌原位种植瘤体内模型,研究GLP、DDP及GLP+DDP联合用药对模型小鼠的治疗,进一步探讨GLP逆转卵巢癌耐药的作用及其机制。具体研究如下:在体外成功诱导建立了稳定的人卵巢癌细胞耐顺铂细胞系SKOV-3/DDP,用于实验研究。实验采用GLP、DDP的不同浓度作用于SKOV、SKOV-3/DDP细胞,通过MTT法检测GLP、DDP对SKOV、SKOV-3/DDP细胞的增殖抑制率的影响,结果发现GLP、DDP对SKOV细胞的增殖均有抑制作用,DDP的抑制作用优于GLP;DDP对SKOV-3/DDP细胞的增殖抑制作用差,加大剂量抑制作用呈剂量依赖性增加;GLP对SKOV-3/DDP细胞的增殖有抑制作用,且随GLP剂量增加和作用时间延长抑制作用明显增加。GLP、DDP二者联合用药,对SKOV、SKOV-3/DDP细胞的增殖抑制率明显升高,说明GLP、DDP具有协同作用。根据GeneBank中GSTM1、GSTT1、GSTP1的基因序列设计引物,取最佳GLP、DDP浓度和作用时间作用SKOV-3/DDP细胞,通过RealTime-PCR技术扩增得到GSTM1、GSTT1、GSTP1基因片段,检测耐药基因GSTM1、GSTT1、GSTP1表达差异;Western-blotting检测GSTM1、GSTT1、GSTP1相关耐药蛋白差异表达。结果显示:GLP组、DDP组SKOV-3/DDP细胞的GSTM1、GSTT1、GSTP1基因及对应蛋白表达均降低,与对照组相比较,存在显著差异,具有统计学意义(P0.05)。GLP、DDP联合效果更显著。实验提示GLP是通过抑制SKOV-3/DDP细胞耐药基因GSTM1、GSTT1和GSTP1的表达来实现逆转SKOV-3/DDP细胞对DDP耐药。GLP、DDP单独和联合作用SKOV-3/DDP细胞,通过荧光显微镜观察细胞内ROS水平;Real-timePCR检测抗氧化基因GSH-Px和CAT的表达差异,了解细胞内过氧化物的清除情况。结果显示:GLP联合DDP组肿瘤细胞内ROS水平增加,GSH-Px和CAT基因的表达量明显下降。证实GLP是通过降低氧自由基清除剂GSH-PX和CAT的活性,增加肿瘤细胞内ROS水平,实现促进肿瘤细胞的凋亡作用。在GLP联合DDP作用SKOV-3/DDP细胞后,通过光学相差显微镜观察细胞形态学变化,显示GLP组SKOV-3/DDP细胞增殖缓慢,并伴有细胞分裂相减少,与对照组相比细胞数量明显减少。DDP组SKOV-3/DDP细胞24h后细胞贴壁不佳,部分细胞变圆,体积萎缩;G L P联合D D P组SK O V-3/D D P细胞大部分细胞变圆,体积缩小且有部分细胞漂浮。G L P、 D D P单独和联合作用SK O V-3/D D P细胞后,通过吖啶橙/溴化乙锭染色荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡,发现G LP、 D D P单独作用于S KO V-3/D D P细胞后,细胞凋亡增加; G L P联合D D P用药后SK O V-3/D D P细胞凋亡尤为明显。以上结果说明,G L P联合D D P应用,通过降低耐药基因G ST M1、 G ST T1和G S T P1的表达来实现逆转SK O V-3/D D P细胞D D P耐药。通过降低抗氧化基因表达,减少细胞内过氧化物的清除,增加肿瘤细胞内R O S水平,实现促进肿瘤细胞凋亡的作用。 G L P、 D D P单独和G L P联合D D P应用,光学显微镜观察细胞形态学、吖啶橙/溴化乙锭染色荧光显微镜观察和流式细胞仪检测证实细胞凋亡存在。证实G LP联合D D P提高S KO V-3/D D P细胞对D D P的敏感性,诱导SK O V-3/D D P细胞凋亡,发挥协同抗肿瘤作用。在体内模型中,应用环磷酰胺免疫抑制小鼠后,分别采用SK O V-3/D D P细胞株、 S KO V-3/D D P细胞球建立小鼠卵巢癌腹腔种植瘤动物模型,研究发现SK O V-3/D D P细胞球对小鼠具有更高的侵染率(P 0.05)。小鼠免疫抑制后采用腹腔种植瘤组织块建立小鼠卵巢癌原位种植瘤动物模型, H E染色观察卵巢癌组织病理学改变,证实小鼠卵巢癌原位种植瘤模型构建成功; G L P、 D D P单独和联合作用于卵巢癌原位种植瘤小鼠,P C R检测G L P、 D D P单独与联合用药组G ST M1、 G ST T1、 G ST P1基因表达。结果显示,与对照组相比,D D P组、G L P组G ST M1、G ST T1基因表达略有下调,D D P联合G L P中剂量组基因表达显著下调,且具有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,D D P组G S T P1基因表达下调, G L P组G ST P1基因表达没有明显变化, D D P联合G LP组G S T P1基因出现上调。这可能与体内环境复杂有关。体内实验结果提示, G LP可能通过降低肿瘤组织中G ST M1等基因表达,发挥抗肿瘤的作用。综上所述,本研究证实了G L P具有逆转D D P耐药卵巢癌细胞的耐药作用,其作 用机制可能是通过降低耐药基因和抗氧化基因的表达,降低氧自由基清除和诱发脂质过氧化,促进细胞凋亡来实现的。这为临床化疗药物逆转剂的开发奠定了实验基础和提供理论根据。


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